[发明专利]一种以肝素为配体的亲和层析介质

说明书

本案涉及一种以肝素为配体的亲和层析介质，以中空介孔二氧化硅微球为内核，在微球内核的表面以及孔道内附着或者填充复合物；附着或者填充复合物的内核被环氧活化，然后继续被多乙烯多胺胺化，多乙烯多胺用于偶联肝素配体；其中，复合物由壳聚糖、聚丙烯酰胺、氢氧化铝和氮化硼组成。本发明的肝素亲和层析介质的肝素配体含量以及对目标蛋白质的固载量大，亲和层析分离效率较高，同时制备工艺简单，能够实现大规模的应用。

技术领域

本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种以肝素为配体的肝素亲和层析介质。

背景技术

随着生物制药领域的迅猛发展，对生物药剂的安全性提出了越来越高的要求，而纯度是保证重组蛋白、抗体、酶等生物药剂安全性的关键。在对这些有机大分子生物药剂分离纯化时，不仅需要提纯浓缩，而且还要求保持一定的空间构型以维持其生物活性。亲和层析是利用生物大分子与介质表面的配体特异性结合而进行选择性分离的一种技术，分离提纯的选择性强，条件较温和，能维持目标蛋白的生物活性。

其中，以肝素(Heparin)为配体的亲和层析介质，能够特异性结合凝血因子、抗凝血酶Ⅲ等血浆蛋白，是使用较多的亲和配体之一。在化学组成上，肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为12～15KDa。目前市场上的肝素亲和层析介质主要以高交联琼脂糖凝胶为基质，采用环氧活化工艺，将肝素偶联到琼脂糖凝胶上，其配基密度约3.5mg/mL,即每毫升琼脂糖凝胶基质键合肝素约3.5mg肝素，对抗凝血酶Ⅲ动态固载量约2mg/mL，现有肝素亲和层析介质的配体含量，以及对目标蛋白质的固载量都不高，使亲和层析分离效率较低，难以实现大规模的应用，同时制备工艺复杂，价格较贵，核心技术为国外公司所垄断。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种以肝素为配体的亲和层析介质。

本发明的技术方案概述如下：

以中空介孔二氧化硅微球为内核，所述中空介孔二氧化硅微球内核的表面以及孔道内附着或者填充复合物；所述附着或者填充复合物的内核被环氧活化；所述被环氧活化的内核被多乙烯多胺胺化；所述多乙烯多胺偶联肝素配体；

其中，所述复合物由下述组分按质量分数组成：

所述多乙烯多胺是乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺的联产物。

优选的是，所述氮化硼的粒径小于10um。

优选的是，所述复合物在乙腈中以悬浮液形式存在。

优选的是，所述中空介孔二氧化硅微球与复合物的质量比为100∶80～85。

优选的是，所述偶联为肝素的末端醛基与多乙烯多胺中的胺基通过还原胺化法实现连接。

优选的是，环氧活化所选用活化剂为环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚。

优选的是，所述中空介孔二氧化硅微球的粒径为30～100μm，所述孔道的平均孔径为40～50nm。

本发明的有益效果是：本发明对肝素亲和层析介质的内核基质进行改进优化，选用具有较大比表面积和耐酸碱骨架结构的中空介孔二氧化硅微球作为内核；微球附着和填充复合物有效改善了亲和层析介质基质的性能，其中壳聚糖增加了二氧化硅微球的生物亲和性，同时壳聚糖和聚丙烯酰胺均富含氨基，能够与肝素配体中醛基通过还原胺化法连接；填充介质中壳聚糖的羟基与环氧氯丙烷或者烯丙基缩水甘油醚反应，使内核被环氧活化，环氧基进一步与多乙烯多胺交联使内核胺化，多乙烯多胺继而与肝素配体中醛基通过还原胺化法偶联；复合物中的胺基与多乙烯多胺的胺基可以同时偶联于肝素配体，增大了肝素亲和层析介质中肝素配体的密度，能够提高分离效率。