[发明专利]一种人纤维蛋白溶解酶的制备方法

说明书

本发明涉及一种人纤维蛋白溶解酶的制备方法。本发明在常温条件下用纤维蛋白溶解酶原激活剂(Plasminogen Activator，PA)激活人纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen,Plg)生成纤维蛋白溶解酶，激活后加入终止剂终止反应，同时该终止剂可抑制纤维蛋白溶解酶降解，然后进行分离纯化即可。

技术领域

本发明涉及医药生物领域，具体而言，涉及一种人纤维蛋白溶解酶的制备方法。

背景技术

人纤维蛋白溶解酶(Plasmin,Plm)，是人纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen,Plg)的活化形式。Plg由791个氨基酸组成的单链丝氨酸蛋白酶，分子量约84～92kDa，在血浆中含量约为180mg/L。Plg在组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂(Tissue plasminogen activator,t-PA)、尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激活剂(Urokinase plasminogen activator,u-PA)、链激酶(Streptokinase,SK)、葡激酶(Staphylokinase,SAK)等作用下断裂Arg⁵⁶¹-Val⁵⁶²肽键，转化成有活性的Plm。

Plm由一条重链(Plasmin Heavy Chain,PlmHC)和一条轻链(Plasmin LightChain,PlmLC)组成，两者由两个二硫键链接。重链含561个氨基酸，分子量约57～63kDa，包括5个环状结构域(Kringle domains,K1～5)。轻链含230个氨基酸，分子量约23～28kDa，包含丝氨酸蛋白酶结构域(Serine protease domain,SP)，活性中心由His⁶⁰³Asp⁶⁴⁶和Ser⁷⁴¹组成。

Plm是纤溶系统的重要组成部分，在纤维蛋白溶解、细胞外基质降解、细胞转移、组织重构、伤口愈合等方面发挥重要作用。临床研究表明，通过导管方式将Plm直接注射至栓塞部位能有效溶解血栓，多余的Plm在血栓溶解后释放被α₂-抗纤维蛋白溶解酶快速中和，避免了在其他部位造成出血。与现有溶栓药物t-PA相比，Plm溶栓效果不亚于t-PA，对于深层静脉血栓、长期栓塞或Plg缺乏患者，Plm溶栓效果明显优于t-PA，而且Plm的出血副作用较小。从效益风险比来说，t-PA效益风险比约为1：1，而Plm效益风险比为4：1。

赖氨酸及赖氨酸类似物，如ε-氨基己酸(Epsilon Amino Caproic Acid,EACA)，能特异性结合Plg的环状结构域，竞争性抑制Plg激活。Plg激活后生成Plm，Plm能作用于自身造成自我降解，短时间内造成活性严重损失，所以体外制备Plm时需在Plg激活后加入保护剂保护Plm活性。

Christopher A.Dadd等在专利Process for the production of a reversiblyinactive acidified plasmin composition中提到用链激酶在2～8℃激活Plg，激活时间为≥8h，激活后将反应混合物中NaCl和EACA的浓度分别调节至0.5mol/L和0.25mol/L用于终止激活反应并抑制Plm降解(US20130164815A1)。

发明内容

发明要解决的技术问题是提供一种方便、稳定的人纤维蛋白溶解酶制备方法。

本发明涉及一种纤维蛋白溶解酶的制备方法，其步骤为：

(1)取人血浆提取的纤维蛋白溶解酶原(Plg)，若为冻存样品则融化，然后用过滤器过滤；

(2)稀释：使用缓冲液稀释步骤(1)中所得的溶液至纤维蛋白溶解酶原至特定蛋白浓度为1.0～6.0mg/ml，调节pH值；

(3)激活：将尿激酶(UK)与步骤(2)中溶液混匀，然后置于23～28℃循环水孵育5～120min；