[发明专利]一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，其特征在于，包括设计的两对特异性引物，具体为：

引物F1: 5'-CGA-GGA-AGG-AAC-TAC-CGA-TG-3'；

引物R1: 5'-GCA-TAA-CGA-CGT-GCA-AAC-TT-3'`；

引物F2: 5'-ACC-GAT-GTT-GAA-TAT-CTT-G-3'；

引物R2: 5'-CTT-GGA-AAG-AGT-TGG-AAT-CT-3'。

2.一种牛巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

（一）权利要求1所述的两对特异性引物；

（二）阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含牛巴贝斯虫1092bp基因片段；

（三）阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

（四）Taq酶。

3.根据权利要求2所述的牛巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞, 经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

4.一种采用权利要求1所述的特异性引物的牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）被检标本DNA提取：取微小牛蜱数只，酒精清洗，每只微小牛蜱放入单独的1.5ml EP dof管，200μL PBS液浸没微小牛蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；

（2）以权利要求1中的外引物F1、R1扩增：在EP dof管中加入处理后的微小牛蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl₂，dNTP，Taq酶，25pmol/μL F1，25pmol/μL R1，DNA模板，ddH₂O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；

（3）以权利要求1中的内引物F2、R2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以F2、R2为第二套引物，在10×PCR Buffer，Mgcl₂，dNTP，Taq酶，25pmol/μL F2，25pmol/μL R2，DNA模板，ddH₂O混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；

（4）PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定；

（5）测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。

5.根据权利要求4所述的牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的第一轮PCR反应条件为：

95℃预热5min ；

95℃保持30s，55℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

6.根据权利要求4所述的牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的第二轮PCR反应条件为：

95℃预热5min ；

95℃保持30s，55℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。

7.根据权利要求4所述的牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）中第一轮PCR50μL反应体系中微小牛蜱样品基因组DNA模板量为5μl，10×PCR Buffer 为5μL，Mgcl₂为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL F1为 1μL，25pmol/μL R1 为1μL， ddH₂O 为31.5μL。

8.根据权利要求4所述的牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（4）中第二轮PCR50μL反应体系中第一轮PCR产物DNA模板量为2μl， 10×PCR Buffer为5μL，Mgcl₂为2μL，dNTP为4μL，Taq酶为0.5μL，25pmol/μL F2 1μL，25pmol/μL R2为1μL， ddH₂O为34.5μL。