[发明专利]一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及生物学技术领域，具体涉及一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法。

背景技术

牛巴贝斯虫是一类经蜱传播，红细胞内寄生的原虫，属于复顶亚门，由该类寄生虫引起的巴贝斯虫病，在世界上许多地区发生和流行，我国各地也常有发生，给畜牧业和国民经济造成巨大损失。牛感染该虫后，常出现贫血、发热、血红蛋白尿、共济失调等症状，严重时引起死亡。该病已经造成了巨大的经济损失，并呈世界范围扩大趋势，因而引起国内外学者的广泛关注。巴贝斯虫是经蜱传播的一种血液原虫，寄生于哺乳动物红细胞、淋巴细胞和其他细胞中，也可以寄生在蜱的各种组织细胞中。目前，普通PCR检测技术仍是诊断寄生在蜱虫体内的巴贝斯虫最常用的方法，但是该方法具有很大的一个缺点－低特异性，扩增时容易产生假阳性。而且在检测牛巴贝斯虫的过程中发现，牛巴贝斯虫与双芽巴贝斯虫之间常出现交叉反应。敏感性和特异性更高的方法，例如反向线性斑点杂交技术（RBL）以及PCR-ELISA等也已经见诸于报道，但是这些方法都存在假阳性率高的缺点。另外，出于经济和实际应用等原因，大部分方法并不适合于流行病学的实验室诊断。基于DNA水平的分子诊断，其敏感性与靶基因扩增的数目是息息相关的。因此选择一个在基因组中高拷贝数的基因作为靶基因将会大大提高现有PCR方法的敏感性。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷及不足，本发明提供了一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物及检测试剂盒与巢式PCR检测方法，建立一种简便、高效、实用的DNA检测方法。该方法可用于牛巴贝斯虫病流行病学调查及快速检测。

本发明采用的技术解决方案是：一种牛巴贝斯虫巢式PCR特异性引物，包括设计的两对特异性引物，具体为：

引物F1: 5'-CGA-GGA-AGG-AAC-TAC-CGA-TG-3'；

引物R1: 5'-GCA-TAA-CGA-CGT-GCA-AAC-TT-3'`；

引物F2: 5'-ACC-GAT-GTT-GAA-TAT-CTT-G-3'；

引物R2: 5'-CTT-GGA-AAG-AGT-TGG-AAT-CT-3'。

一种牛巴贝斯虫巢式PCR检测试剂盒，所述的巢式PCR检测试剂盒包括以下组分：

（一）权利要求1所述的两对特异性引物；

（二）阳性对照：所述的阳性对照为含有目的基因片段的重组质粒，该质粒含牛巴贝斯虫1092bp基因片段；

（三）阴性对照：所述的阴性对照为去离子水；

（四）Taq酶。

所述的阳性对照通过将扩增产物克隆至pUCm-T转化DH5-α感受态细胞, 经酶切鉴定及测序后获得为阳性重组质粒的阳性对照。

一种牛巴贝斯虫巢式PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）被检标本DNA提取：取微小牛蜱数只，酒精清洗，每只微小牛蜱放入单独的1.5ml EP dof管，200μL PBS液浸没微小牛蜱，用样品破碎仪破碎蜱的虫体，吸取破碎后的溶液，加入Trizol试剂裂解，采用常规的酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后用三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶解，-20℃保存备用；

（2）以权利要求1中的外引物F1、R1扩增：在EP dof管中加入处理后的微小牛蜱标本DNA，同时设阴、阳性对照，10×PCR Buffer，Mgcl₂，dNTP，Taq酶，25pmol/μL F1，25pmol/μL R1，DNA模板，ddH₂O混匀后稍离心的50μL反应体系中进行第一轮PCR；

（3）以权利要求1中的内引物F2、R2扩增：以第一轮PCR产物DNA为模板，以F2、R2为第二套引物，在10×PCR Buffer 5μL，Mgcl₂ 2μL，dNTP 4μL，Taq酶 0.5μL，25pmol/μL F2 1μL，25pmol/μL R2 1μL，DNA模板2μL，ddH₂O 34.5μL混匀后稍离心的50μL反应体系进行第二轮PCR；

（4）PCR产物鉴定：取第二轮PCR产物2μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定；

（5）测序：将第二轮PCR产物送测序公司进行序列测定。

所述的步骤（2）中的第一轮PCR反应条件为：

95℃预热5min ；

95℃保持30s，55℃保持1min，72℃保持1min，该步骤进行共30个循环；

末次延伸至72℃，保持10min。