[发明专利]一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种层出镰刀菌（Fusarium Proliferatum）发酵产物的制备方法，其特征在于：

所述的层出镰刀菌发酵产物的制备，即对层出镰刀菌进行液体扩大培养，包括如下步骤：

A、扩大培养：将在改良PDA固体斜面培养基上培养好的真菌菌落，用无菌水冲洗，轻轻刮取菌丝，按10%的接种量接种至液体发酵培养基中，28℃，转速采用100～200rpm，培养3～10天，得到层出镰刀菌发酵液；

所述的液体发酵培养基配方为：碳源：MgSO₄·7H₂O：0.5g/L，KH₂PO₄：1.0g/L，Glucose：38.5g/L，VB₁：50 mg/L，调pH 5.5；氮源：鱼粉蛋白胨：5 g/L，酵母提取物：2.5 g/L，115 ℃，30 min高温灭菌，使用时把氮源按10%的量加入碳源中混匀；

B、菌丝菌液分离：用8层纱布过滤层出镰刀菌发酵液，得到层出镰刀菌菌丝和层出镰刀菌菌液，其中菌丝放入70℃烘干，菌液放置在水浴锅上浓缩；

C、活性测试的供试液：菌丝用适量甲醇浸泡提取3次，得到层出镰刀菌菌丝的甲醇浸泡液；浓缩后的菌液用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，得到各部位的萃取液，即发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位；蒸干备用；

发酵液与菌丝在260～290nm范围内有最大吸收波长；发酵液乙酸乙酯部位的紫外最大吸收峰为262 nm；菌丝甲醇浸泡液的紫外最大吸收峰为215 nm、261 nm；竹叶兰乙酸乙酯部位在200～300nm范围内都有吸收峰，紫外最大吸收峰为276 nm；发酵液的各部位的成分与竹叶兰乙酸乙酯部位成分具有相似性；

所述的层出镰刀菌的分离纯化方法，包括如下步骤：

（1）采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；

（2）消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；

根、茎、叶：自来水表面清洗 4～5次→消毒纸巾吸干水分→75%酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1% 次氯酸钠溶液漂洗5 min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分；其中，叶片仅用酒精消毒；

（3）培养：无菌条件下将叶片切成 5mm×5mm 大小，根、茎切成 5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃ 避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；

所述的改良PDA固体培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，七水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，维生素B1 50mg，琼脂20g，水1000 mL，自然pH；

（4）纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到层出镰刀菌；

所述层出镰刀菌在改良PDA固体培养基上的最适生长温度为28℃，周期为7天，生长速度慢，菌丝浓密，菌落呈同心环状，内部为紫红色，边缘白色，蓬松，中心部分凸起；培养基为紫红色偏黑，在光学显微镜下和看到镰刀状的游离孢子；在液体培养基中的温度为28℃，转速为160rpm，生长周期为7天，发酵液呈深紫红色，有淡淡葡萄酒香味。

2.根据权利要求1所述的层出镰刀菌发酵产物的制备方法，其特征在于：

步骤A中所述的转速采用160r/min，培养时间为7天。

3.一种层出镰刀菌发酵产物，其特征在于：通过权利要求1或2所述的制备方法制备得到。

4.权利要求3所述的层出镰刀菌发酵产物在广谱抑菌和抗氧化方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述抑菌指对革兰氏阳性、阴性细菌的抑制作用，以及对植物病原真菌的抑制作用，应用于农业上的病害防治。