[发明专利]一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用

说明书

本发明公开一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用，属于药用植物内生菌研究领域。利用本发明的方法从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品中分离纯化得到的菌株发酵产物在抗菌、抗氧化方面具有良好作用尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。通过从药用植物竹叶兰的内生菌中发现活性较好地次级代谢产物，大大提高了研究效率，缩短了研究周期。本发明的方法工艺简单，效率高，并且活性较好，培养大大缩短。可用于活性单体化合物的分离及应用。

技术领域

本发明属于药用植物内生菌研究领域，具体的说，本发明涉及一种竹叶兰内生真菌的分离纯化，以及其发酵产物抗菌、抗氧化方面的应用，尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。

背景技术

竹叶兰(Arundina graminifolia(D.Don)Hochr.)为兰科竹叶兰属植物，别名长杆兰、百样解，是傣族常用解药，常用于治疗疮痈肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤等。菌根真菌可以侵入根被(皮层)组织形成内生菌根，自然界中,几乎所有的兰科植物都与真菌共生形成菌根，植物内生菌(Endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。由于与植物协同进化，所以人们期望从内生菌内找到与宿主植物具有相同或相似的化学成分，以保护濒危药用植物物种，缩短研究周期，提高发现新药的效率。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法。通过结合ITS序列比对与系统发育树归属，对其进行分子生物学鉴定，结果表明其序列与Fusarium Proliferatum同源性≧99％，因此，鉴定其为层出镰刀菌。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法获得的竹叶兰内生真菌发酵产物的应用，通过测试对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性，以及对菜心炭疽、稻瘟菌等14种植物病原真菌的抑菌活性，发现该真菌的次级代谢产物具有广谱抑菌性。

利用DPPH法测试竹叶兰内生真菌发酵产物的抗氧化性能，发现其具有很好的抗氧化性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，所述竹叶兰是在云南采集的无病虫害的新鲜野生竹叶兰；所述分离方法中，消毒酒精的浓度为75％，次氯酸钠溶液的浓度为1％，消毒时间为2～5min，所用固体培养基采用改良PDA固体培养基。

优选的，培养基采用PDA综合固体培养基，能够分离得到更多的内生真菌；

一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；

(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；

根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分(叶片仅用酒精消毒)；

(3)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；

(4)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ-3，名称为层出镰刀菌(FusariumProliferatum)TJ-3；