[发明专利]里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用

说明书

本发明公开了里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由具有分泌表达里氏木霉的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌构成。分泌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β‑葡聚糖苷酶能够有效降解羧甲基纤维素钠，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合能够有效降解苜蓿中的木质纤维素，提高了苜蓿青贮饲料的发酵和营养品质，具有可观的经济价值。

技术领域

本发明属于应用工业微生物领域，公开了里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合在调制优质苜蓿青贮饲料中的应用。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合由能够分泌表达里氏木霉内切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌、能够分泌表达里氏木霉外切葡聚糖酶的转基因工程乳酸乳球菌和能够分泌表达里氏木霉β-葡聚糖苷酶的转基因工程乳酸乳球菌组成。分泌的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶能够有效降解羧甲基纤维素钠，可用于食品、能源、医药、饲料、纺织、洗涤等工业。里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌组合能够有效降解苜蓿中的木质纤维素，提高了苜蓿青贮饲料的发酵和营养品质，具有可观的经济价值。

背景技术

木质纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物干重的30％～50％，是地球上分布最广、再生性最佳的结构性碳水化合物，占地球总生物量的40％。对人类而言，木质纤维素即是自然界中数量最大的可再生性能源，也是自然界碳素循环的中心环节。木质纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、环境污染、粮食和饲料短缺等问题具有十分重要的意义。

纤维素酶是分解木质纤维素的一类酶。里氏木霉(Trichoderma reesei)是高效产纤维素酶的真菌，其产生的纤维素酶具有酶系完全，安全，活性高，能分泌到细胞外，便于分离提纯等优点，被广泛应用于能源、食品、医药、饲料和化工等工业领域。根据催化反应功能的不同，纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶构成，只有三者同时存在时才能彻底有效地降解木质纤维素。内切葡聚糖酶可随机水解木质纤维素非结晶区的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端，外切葡聚糖酶可从纤维素线状分子的非还原性末端水解切下纤维二糖单位，β-葡聚糖苷酶则将纤维二糖水解成葡萄糖。三个成分相互协同，完成对木氏纤维素的降解，缺乏任意一种酶都无法彻底地将纤维素进行良好地降解。里氏木霉表达内切葡聚糖酶基因有egl1、egl2、egl3、egl4和egl5,其中对egl1、egl2和egl3基因的研究较多，egl3基因编码的内切葡聚糖酶，具有特异性强和活性高的特点。目前，我国构建出的egl1和egl2基因工程大肠杆菌分泌表达内切葡聚糖酶的效果差。里氏木霉表达外切葡聚糖酶的基因分别为cbh1和cbh2。目前，我国对cbh1和cbh2基因工程大肠杆菌和乳酸菌进行了研究，但尚未将构建的cbh2基因工程乳酸菌应用于降解含有木质纤维素的材料。里氏木霉表达β-葡聚糖苷酶的基因分别是bgl1和bgl2，bgl1比bgl2长且含有的内含子较多和较长的信号肽序列。目前，我国仅成功克隆和表达bgl2基因的大肠杆菌，未构建出分泌表达bgl1基因的大肠杆菌和乳酸菌。在纤维素降解过程中，所生成的纤维二糖或寡糖的积累会抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性，而β-葡萄糖苷酶能够从非还原端将上述二者作用形成的纤维二糖或纤维寡糖水解，最终形成葡萄糖，是纤维素降解过程中关键的限速酶，这也是高效利用纤维物质的关键。构建出分泌表达里氏木霉bgl1基因的乳酸菌是成功应用里氏木霉木质纤维素酶基因工程乳酸菌的关键。

青贮饲料是奶牛的当家饲料，约占日粮的50-70％。随着生物技术的飞速发展，人们发现添加纤维素酶或乳酸菌提高青贮饲料的发酵品质更经济、方便、安全，其主要原因是纤维素酶降解纤维素产生水溶性糖为乳酸菌发酵提供充足底物，接种的乳酸菌迅速成为优势菌群，促进乳酸发酵，但是添加纤维素酶或乳酸菌对青贮饲料发酵品质的改善效果常常不稳定。因此，混合添加纤维素酶和乳酸菌提高了苜蓿、全株水稻、小麦秸秆、大黍、玉米秸秆等青贮饲料的发酵品质，但生产成本提高，导致纤维素酶和乳酸菌混合应用于生产实践的比例较低。