[发明专利]一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法

权利要求书

1.一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

S1、大酱的制作：取实验室自制酱曲2505g破碎后入坛，加入6000ml的水，搅拌均匀，接地衣芽孢杆菌0.06g，放置低温冷藏箱中发酵一周后加无碘盐1270g，使酱中盐浓度控制在13％左右，并于低温冷藏箱中发酵；

S2、实验小鼠的饲养：选取40只健康的雄性清洁级昆明种小鼠，小鼠体重维持在20±2g，相对湿度为45％-65％，室温设置24℃±2℃，要及时供给食物和饮水，使其适应1周后，方可开始试验；

S3、大酱溶液的制备：从S1中取出发酵两个月后的大酱约30g并置于搅拌机中搅碎后分别取4g、8g、16g各加入蒸馏水200ml定容，分别配置成浓度分别为0.02g/ml、0.04g/ml、0.08g/ml的溶液，即大酱低、中、高剂量；

S4、受试物剂量设计：将S2中的小鼠随机分成四组，并用标号标记，即空白对照组、低浓度大酱溶液组、中浓度大酱溶液组、高浓度大酱溶液组，将S3中低、中、高剂量分别设定为0.2g/kg/d、0.4g/kg/d、0.8g/kg/d，并经口灌胃摄入受试物，同时空白对照组灌以等体积的蒸馏水；

S5、小鼠爬杆时间的检测：在每次大酱溶液灌胃30min后，分别将各组小鼠依次放置于爬杆架的有机玻璃圆柱上，圆柱直径0.8～1.0cm，下端距水面约20cm，用秒表记录小鼠从被放上圆柱到滑落水中间隔的时间，累计3次作为小鼠的爬杆时间；

S6、小鼠负重游泳时间的检测：在每次灌胃30min后，在各组小鼠尾部负重5％体重的铅皮，分别将负重小鼠依次放于游泳箱中，进行力竭性游泳试验，力竭标准为小鼠的嘴和鼻子在水面下8s不抬头，则可判定小鼠力竭，记录每只小鼠自游泳开始至力竭沉入水中死亡的时间，将其作为小鼠的游泳时间；

S7、小鼠体重及脏器系数的检测：试验过程中，每3d进行一次小鼠体重的测量，解剖后测定不同试验剂量组小鼠不同脏器的湿重，计算它们与单位体重(100g)的比值，计算出脏器系数；

S8、小鼠肝糖原、肌糖原储备量的检测：

1)葡萄糖标准曲线的绘制

首先配制浓度分别为0mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml和2.5mg/mg的标准葡萄糖溶液各100ml，然后分别取2ml加入6支编好号的试管中，再在各试管中分别加入10ml蒽酮试剂，在沸水浴中放置15min，之后冷却至室温，测定其在620nm波长下的吸光度，以标准葡萄糖溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘出标准曲线，标准曲线方程为：y＝2.3751x+0.082

2)小鼠肝糖原、肌糖原的测定

在小鼠力竭性游泳后，摘眼球取血处死，血液立刻冷藏于4℃冰箱，解剖取小鼠肝脏，用生理盐水浸泡去除血液，并去除多余脂肪组织，用滤纸吸干后称量剪取，放入-20℃冰箱保存，严格按照试剂盒方法测量肝糖原和肌糖原储备量，将各组试管的吸光度代入标准方程，用下式计算各组小鼠肝糖原和肌糖原的含量：

肝/肌糖原的含量(mg/100g肝/肌)＝[(OD-0.0822)/2.3751]×2×(V/N)×0.9×100

其中，OD：样品管吸光度

2：溶解糖原时用的蒸馏水体积(ml)

V：提取液体积(ml)

m：取肝脏/肌肉组织的质量(g)

0.9：葡萄糖和糖原转换系数

各剂量组和对照组的肝/肌糖原量测出后，即可对比出大酱的抗疲劳作用；

S9、对比结果：将各个实验检测数据与空白对照数据利用SPSS18.0进行软件系统分析，选择最小显著差法进行多重比较，且P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01则表示有极显著性差异，P＞0.05为无统计学意义。

2.根据权利要求1所述的一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法，其特征在于：在S1中，加入的水为自来水煮沸100℃后冷却至40℃再加入。

3.根据权利要求1所述的一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法，其特征在于：在S5中，爬杆架放置在100×80×50cm规格的塑料容器中，且容器内装入约15cm高度的水。

4.根据权利要求1所述的一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法，其特征在于：在S6中，游泳箱规格为90×45×45cm、水深约35cm、水温为25℃±1℃。

5.根据权利要求1所述的一种传统大酱抗疲劳作用的检测方法，其特征在于：在S8中，蒽酮试剂为用72％的浓硫酸配制，且溶液中含0.05％的蒽酮，1％的硫脲，配成后用锡箔纸包好存置冰箱中。