[发明专利]稀有细胞单细胞水平的分离及检测方法

权利要求书

1.一种对人体体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含如下步骤：

A：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液中的有核细胞包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的从病变组织脱落的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至5微米的一个或多个微孔，每片子滤膜中截留的有核细胞能独立于其他子滤膜上的有核细胞被单独回收，

进行加压过滤使大部分白细胞通过复合滤膜，以使得子滤膜总数目的50%以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个，其中当每片子滤膜中含一个微孔时进行10-25mbar的加压过滤，当每片子滤膜中含有多个微孔时进行5-25mbar的加压过滤；

B：在步骤A的过滤前，或者在过滤后的复合滤膜上，对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；及

C：对复合滤膜上截留的有核细胞进行荧光成像，从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。

2.如权利要求1所述的分离的方法，其中：

步骤A中，所述体液样本为外周血、胸水或脑脊液，所述病变细胞是其中的肿瘤细胞，

步骤A中，添加至复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为子滤膜总数目的50倍以上，

步骤B中，还包括对有核细胞用荧光标记的白细胞标志物进行标记处理，且

进一步包括步骤D：将确定截留了肿瘤细胞和0-10个白细胞的子滤膜刺破，而将子滤膜与其截留的细胞一起进行回收。

3.如权利要求2所述的分离的方法，其中：

所述复合滤膜具有4000片以上的子滤膜，且每片子滤膜上有1个所述微孔；

步骤A中添加至复合滤膜上的细胞悬液基本上不含红细胞，且白细胞浓度为不超过200万个/ml；且

添加至一复合滤膜上的细胞悬液的白细胞总数目为50万个以上。

4.如权利要求3所述的分离的方法，其中：

所述微孔的直径为4-5微米；

所述细胞悬液中白细胞的浓度为不超过100万个/ml；

添加至一复合滤膜的所述细胞悬液的白细胞总量为100万个以上；且

过滤压力为15-25mbar，并使得每次过滤后，复合滤膜的70%以上片数的子滤膜各自截留的白细胞数不超过10个。

5.如权利要求2所述的分离的方法，其中：

所述复合滤膜的每片子滤膜上有2-10个所述微孔；

步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是外周血、胸水或脑脊液，任选地，是经稀释和/或经去除红细胞处理的；且

添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为50万个以上。

6.如权利要求5所述的分离的方法，其中：

每片子滤膜上有3-10个微孔，所述微孔的直径为4-5微米；并且/或者

步骤A中添加至复合滤膜上的所述细胞悬液是外周血、胸水或脑脊液，白细胞的浓度为不超过300万个/ml；并且/或者

添加至一复合滤膜的所述白细胞总数目为100万个以上；且过滤压力为10-20mbar，使得每次过滤后，复合滤膜的70%以上片数的子滤膜各自截留的有核细胞数不超过10个。

7.如权利要求2-6任一项所述的分离的方法，其中，所述荧光标记的病变细胞标志物是葡萄糖类似物。

8.权利要求1-6任一项所述的分离的方法，其中所述复合滤膜包括：

1000孔以上且10万孔以下的阵列小孔板；和

位于阵列小孔板各小孔的底部的各所述子滤膜，

小孔与子滤膜的直径为50-150微米。

9.如权利要求1-6任一项所述的分离的方法，其中，

基于所述体液样本，细胞悬液中作为稀有细胞的病变细胞相对于作为多数细胞的白细胞未经富集处理；且

白细胞总数目与复合滤膜中子滤膜总数目的倍数的上限选择为不导致过滤时复合滤膜的堵塞。