[发明专利]稀有细胞单细胞水平的分离及检测方法

说明书

一种对体液样本中的稀有细胞进行单细胞水平的分离的方法，包含：将体液样本以细胞悬液的形式均匀添加至复合滤膜上，细胞悬液包括作为多数细胞的白细胞和作为稀有细胞的病变细胞，其中复合滤膜包括阵列的1000片以上独立的、可寻址的子滤膜，每片子滤膜中含有孔径在3微米至10微米的微孔进行加压过滤以使得50％以上的子滤膜各自截留的白细胞的数目不超过10个；对有核细胞用荧光标记的病变细胞标志物进行标记处理；对截留的有核细胞进行荧光成像从而确定截留了具有特定荧光特征的病变细胞的子滤膜在复合滤膜上的位置。本方法可以快速、简便和高回收率地以单细胞水平分离稀有细胞。

技术领域

本发明属于稀有细胞分离和检测领域，具体涉及一种从人体体液中分离和检测稀有细胞的方法。

背景技术

人外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)是指由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶。CTC反映了肿瘤病灶的分子特征，并且是肿瘤血行转移的直接来源，因此CTC检测越来越引起重视。CTC在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞，因此从外周血中快速、高效的分离循环肿瘤细胞是后续对循环肿瘤细胞计数、以及分子、功能分析的前提。同时，由于肿瘤细胞具有异质性，因此对于CTC的单细胞分析也极为重要。

目前CTC的检测主要分两步，第一步是CTC的富集分离，第二步是对富集后的CTC进行进一步的鉴定。

CTC的富集分离方法主要依赖于肿瘤细胞与血液细胞在物理、化学或生物学性质的不同，可分为两类。一类是基于CTC与血液细胞物理性质上的差异，如细胞大小，肿瘤细胞一般来说比血液细胞更大、更不容易变形。针对这一物理性质的差异，典型的富集分离方法就是采用滤膜的方法富集CTC并进一步通过病理学染色或免疫染色来鉴定CTC。由于一定比例的白细胞同样尺寸较大，这一方法往往会在富集后仍有较多的白细胞。更重要的是，由于CTC卡在滤膜上的微孔内，这一方法无法将富集到的CTC取出做进一步的分子分析，更无法进行单细胞的分离。另一类CTC富集分离方法主要基于CTC表面与血液细胞不同的独特抗原，通过针对CTC表面独特抗原的抗体或核酸适配体实现CTC的捕获并与血液中其他细胞分离。但目前缺乏肿瘤细胞特异性抗原，因此在捕获后还需进一步的免疫染色以鉴定CTC。可用于捕获CTC的抗原包括上皮细胞抗原EpCAM，器官特异性标志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT标志物等。针对这些抗原的抗体常被修饰于磁球或微流控复合滤膜表面以捕获血液中的CTC。通过微流控复合滤膜捕获的CTC同样存在难以释放CTC以进行分子检测的问题。通过磁球捕获的CTC(如目前唯一获得美国FDA批准的CellSearch系统)虽处于游离状态，但即使在捕获后仍然存在较多血液细胞的干扰，难以获得纯的CTC进行分子检测，更难以将CTC分离成单细胞进行检测。

对富集后的CTC进行进一步的鉴定。传统的标记物(上皮细胞标记物等)鉴定血液中的CTC，在可靠性和获得细胞的活性上被学者们质疑。基于“瓦博格效应”，与PET-CT原理类似，即由于肿瘤细胞内葡萄糖转运蛋白的过度表达以及增强的己糖激酶、磷酸果糖激酶及丙酮酸脱氢酶活性，使肿瘤细胞的葡萄糖无氧代谢活动增强。所以可以通过检测细胞摄取葡萄糖的水平来区别肿瘤细胞和正常体细胞。

由于CTC的分子检测，尤其是单细胞分子检测极为重要，因此目前CTC领域面临的重大技术挑战是无法获得纯的CTC群体进行分子分析，以及获得单个CTC进行单细胞分子分析。解决这一问题的一个可行的思路是通过显微操作设备将鉴定到的CTC一一取出，或置于不同的PCR管或384孔板内进行单细胞分子分析，或置于同一个PCR管内合并起来进行后续分子分析。但显微操作设备的不足之处在于非自动化操作以及容易在操作、转移单细胞过程中丢失细胞，其原因是分离细胞常采用毛细管，而毛细管容易黏住细胞无法成功转移，或虽能转移但无法准确转移至PCR管底部导致后续分子反应难以进行。

因此，针对目前稀有细胞富集过程复杂、单细胞回收困难等情况，需要更高自动化的简便、高效的稀有细胞单细胞水平的分离方法。

发明内容