[发明专利]纳豆激酶活力的检测方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种纳豆激酶活力的检测方法，该方法包括以下步骤：制备血栓管、溶解血栓、测定标准溶液的溶栓长度、绘制标准曲线以及测定待测样品的纳豆激酶活力。该方法准确度较高，且数据波动小，稳定性较高。另外，该方法所使用的样品量较少，无需复杂仪器，且能同时测定多组样品，适宜用于的纳豆激酶激活剂或抑制剂的高通量筛选中。

技术领域

本发明涉及激酶检测技术领域，特别是涉及纳豆激酶活力的检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术

纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶，是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白酶，具有较强的溶栓作用，其在体内溶栓活力为纤溶酶的四倍。

纳豆激酶具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。此外，每百克纳豆的价格与1500美元的尿激酶相当，另外，尿激酶的半衰期为4-20分钟，而纳豆激酶的活力可持续8-12h，且纳豆激酶抑制纤维蛋白的效果较尿激酶和纤维蛋白溶酶更好，且相对耐热。故可知纳豆激酶与其他溶栓药物相比成本低、安全性好、分子量小、口服效果好、溶栓活力高、作用持续时间长等，有望被开发为一种市场竞争能力强的新型溶栓药剂及心脑血管保健品。因此纳豆激酶活力的检测方法显得尤为重要。

传统的纳豆激酶活力检测方法包括：IU纤维蛋白平板法、纤维蛋白快速溶解时间法(CLT法)、四肽底物法、酶联免疫吸附(ELIZA)法。

其中，IU纤维蛋白平板法通过观察激酶在纤维蛋白平板上形成的水解圈，测量水解圈的直径来测定相应纳豆激酶的活力。但因为纤维蛋白凝胶的密度分布非常不均，水解圈的形状往往不规则，以及边缘模糊难辨，而且对水解圈直径的认定存在人员视觉差异，导致数据波动性强，重复性差，操作繁琐，不具权威依据。

另外，CLT法是将纳豆激酶、纤维蛋白原、凝血酶在生理盐水中猛烈搅拌混合后，置于37℃水浴中，形成充满气体的纤维蛋白柱凝胶并开始计时，直至气泡停止生成。通过计算产生气泡的时间来反推酶活。此方法的缺点在于方法迂回间接，精度较差，重复性差，人为误差难以控制，操作繁琐，不具权威依据。

再者，四肽底物法通过利用纳豆激酶与枯草蛋白酶的高同源性，使四肽底物和纳豆激酶反应一段时间后，再用紫外分光光度法测定其小分子产物的浓度来测定纳豆激酶的活力。纳豆激酶在发酵生产的过程中会伴随有大量枯草蛋白酶类的产生，因此对纳豆激酶的活力测定带来干扰。此外，四肽底物较为昂贵，导致此法测定成本过高。

而酶联免疫吸附(ELIZA)法所需的设备及试剂较为苛刻，适用范围受限。

发明内容

基于此，提供一种稳定性较高的纳豆激酶活力检测方法。

一种纳豆激酶活力的检测方法，包括以下步骤：

(1)制备血栓管

取数根毛细管，分别吸取凝血酶液后，再吸取纤维蛋白原溶液，吸取的所述凝血酶液的体积与所述纤维蛋白原溶液的体积比为1:100～1:20，然后密封所述毛细管的非吸取端，静置，待所述毛细管中的溶液凝固后形成血栓，即得所述血栓管，并分别记录所述血栓的长度，作为第一血栓长度；

(2)溶解血栓

配制不同浓度梯度的尿激酶标准溶液，将(1)中制备的所述血栓管分别置于不同浓度的所述尿激酶标准溶液中，再密封所述尿激酶标准溶液，分别在相同温度下，反应相同时间后取出，所述血栓管内有液体状物质生成；

(3)测定所述标准溶液的溶栓长度

使用加热法除去步骤(2)中生成的所述液体状物质，并记录血栓管中剩余的所述血栓的长度，作为第二血栓长度，所述溶栓长度为所述第一血栓长度减去所述第二血栓长度；

(4)绘制标准曲线

绘制所述尿激酶的浓度与所述溶栓长度的标准曲线；