[发明专利]一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法

权利要求书

1.一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于包括： 1）3条上游引物和3条下游引物； 2）阳性对照重组质粒模板； 3）PCR反应液；其中，所述的3条上游引物和3条下游引物序列分别为：

扩增褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nl-F: 5’- CAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTAC -3’

Nl-R: 5’- GCTTGCTGTTAAGTCACAAG -3’

扩增拟褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nb-F: 5’- GCTAGTCATTACATTGTATGTTGG -3’

Nb-R: 5’- ACTTTCTGGTCCGACTAACAT -3’

扩增伪褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nm-F: 5’- TGTATGATGGCAGCATTAATCT -3’

Nm-R: 5’- GAAATTTGTATGGTTCAATGTGTAG -3’。

2.如权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于其中所述的阳性对照为：分别含褐飞虱ITS1、拟褐飞虱ITS1、伪褐飞虱IST2区核苷酸序列的重组质粒标准品。

3.如权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的PCR反应液的成分为：2 × 扩增缓冲液Mix，5 μL；10 μΜ/L 引物，Nl-F和Nl-R各0.15 μL、Nb-F和Nb-R各0.12 μL、Nm-F和Nm-R各0.20 μL；待测样品粗组织液，1 μL；1.0 U/μL Taq polymerase，0.2 μL；ddH₂O，补足10 μL。

4.如权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的PCR反应体系中引物对间的比例为：褐飞虱：拟褐飞虱：伪褐飞虱=15 : 12 : 20。

5.采用权利要求1所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒的鉴别方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取待测飞虱单头个体，制备飞虱粗组织液；

2）制备含上述6条引物的PCR反应体系；

3）分别取阳性对照模板和待测飞虱制备的粗组织液，加入到PCR反应液中进行基因扩增反应；

4）取扩增后产物8 μL点样于2.0 % (W/V)琼脂糖凝胶，其中含0.1-0.5 g/ml的Gelred，以100 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；

5）结果判定，将待测样品与阳性对照电泳结果进行对比，待测样品与阳性对照同时扩增出237 bp条带的，判定为褐飞虱；待测样品与阳性对照同时扩增出362 bp条带的，判定为拟褐飞虱；待测样品与阳性对照同时扩增出152 bp条带的，判定为伪褐飞虱。

6.如权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于步骤1）中粗组织液的制备方法包括：1）取单头待测飞虱，放入2 ml离心管中；2）加入200 ml蒸馏水，用自动研磨机研磨，8000 rpm × 1 min；3）研磨液无需离心即为飞虱粗组织液。

7.如权利要求5所述的鉴别方法，其特征在于步骤3）中基因扩增反应的条件为：预变性，95℃，2 min；变性98℃，10 s；退火 58℃，15 s；延伸，68℃，20 s，进行40个循环扩增；终延伸，68℃，5 min。