[发明专利]一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学鉴别技术领域，具体涉及一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法。

背景技术

褐飞虱[Nilaparvata lugens (Stål)]是亚洲稻区最严重的水稻害虫之一，具远距离迁飞习性。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，目前主要采用灯诱监测。测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是褐飞虱预测预报的重要依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。

拟褐飞虱[Nilaparvata bakeri (Muir)]和伪褐飞虱[Nilaparvata muiri China]是褐飞虱的同属近似种，并不以水稻为适宜寄主。拟褐飞虱、伪褐飞虱与褐飞虱具有广泛的共同分布区域，发生季节也有交叉，且都具有趋光性，对预测预报的准确性造成了严重影响。褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱形态非常相似，肉眼难以区分，需专业植保人员借助于显微镜才能鉴别区分，耗时费力，且不能鉴别残缺的飞虱个体。

聚合酶链式反应（PCR）技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于昆虫学领域，如系统进化树的构建等。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，是在同一反应体系中同时加入多对引物扩增多条DNA片段，采用这一技术可实现多种昆虫种类的同步鉴别。但多重PCR检测的准确性受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、引物的特异性、PCR反应条件，不同样本对试剂的竞争等。

昆虫核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）具有进化速率快，物种间差异较大而物种内比较保守，拷贝数多的特点，被广泛应用于物种鉴别。崔亚丽等（2012年）曾利用ITS区设计引物，以DNA为模板，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重PCR检测技术，但具有耗时长、耗费大的缺点，且多重和单重引物对扩增条带长度有一定差异。基于当前现状，迫切需要建立一种快速、简便、经济的分子生物学鉴定方法。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒及其鉴别方法的技术方案，其针对三种飞虱的ITS序列，在验证ITS区序列的基础上，设计并优化了引物对及配比，以粗组织样品为模板，节省了提取DNA的所耗费的时间和试剂，建立了更加快速、准确、灵敏、高通量、低成本地鉴别三种飞虱的多重PCR检测试剂盒及鉴别方法，为分子生物学方法鉴别褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱提供选择。

所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于包括： 1）3条上游引物和3条下游引物； 2）阳性对照重组质粒模板； 3）PCR反应液；其中，所述的3条上游引物和3条下游引物序列分别为：

扩增褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nl-F: 5’- CAACTAGGTAAGTAAAGGTGCTAC -3’

Nl-R: 5’- GCTTGCTGTTAAGTCACAAG -3’

扩增拟褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nb-F: 5’- GCTAGTCATTACATTGTATGTTGG -3’

Nb-R: 5’- ACTTTCTGGTCCGACTAACAT -3’

扩增伪褐飞虱的特异性引物的核苷酸序列为：

Nm-F: 5’- TGTATGATGGCAGCATTAATCT -3’

Nm-R: 5’- GAAATTTGTATGGTTCAATGTGTAG -3’。

所述的一种快速鉴别飞虱种类的多重PCR试剂盒，其特征在于其中所述的阳性对照为：分别含褐飞虱ITS1、拟褐飞虱ITS1、伪褐飞虱IST2区核苷酸序列的重组质粒标准品；

褐飞虱IST1序列 （595 bp）：