[发明专利]一种生物防霉剂及其制备方法

权利要求书

1.一种生物防霉剂，其特征在于，按重量份数计由以下配方组成：

抗菌蛋白或其粗品：2-8份；

成膜剂：0.5-4份；

增塑剂：0.5-5份；

交联剂：1-4份；

所述抗菌蛋白的制备包括以下步骤：

(1)B.amyloliquefaciens F1发酵液的制备

将B.amyloliquefaciens F1菌株按2-6％的接种量接种于含5mL营养肉汤的试管中摇床培养得B.amyloliquefaciens F1种子液。吸取B.amyloliquefaciens F1种子液，以2-6％的接种量添加到装载量20-40％发酵培养基的锥形瓶中，摇瓶发酵得发酵液；

(2)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白粗品的制备

首先取1L上述B.amyloliquefaciens F1发酵液进行超滤浓缩，即得浓缩液。在超滤浓缩液中，缓慢加入硫酸铵，使其达到一定饱和度，4℃静置过夜，之后8000-10000r/min离心20-30min，收集沉淀。用原液1/10-1/20体积PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋后采用浓度相同的缓冲液透析，并且每隔一段时间换一次透析液，即得抗菌蛋白粗品；

(3)B.amyloliquefaciens F1抗菌蛋白的分离纯化

采用NGC层析系统进行初步纯化。透析后的抗菌粗蛋白通过0.22μm微孔滤膜过滤后，上样于离子交换柱，用缓冲液平衡，洗脱液进行线性梯度洗脱，收集主要分离组分；收集离子交换分离后具有抑菌活性的蛋白溶液，手动上样于Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，进行洗脱，收集具有抑菌活性的蛋白溶液，即得高纯的抗菌蛋白。

2.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于，所述成膜剂为海藻酸钠、壳聚糖、淀粉、大豆蛋白及卡拉胶中的任意一种；增塑剂为甘油、吐温-20、山梨醇、甘露醇中的任意一种；交联剂为氯化钙、柠檬酸钠中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(1)中，所述B.amyloliquefaciens F1种子液制备，30-37℃摇床振荡培养18-24h；所述摇瓶发酵为30-37℃发酵48-72h。

4.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：发酵培养基为：蛋白胨10.0g，牛肉浸出粉3.0g，氯化钠5.0g，2g柠檬酸铵，4g蔗糖，0.2g硝酸钾，1000mL水。

5.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(2)中，所述超滤浓缩所用的超滤膜截留分子量为3-30kDa，硫酸铵饱和度为40-60％；PBS浓度为10mmol/L、pH 8.0；透析袋孔径为3-30kDa，透析48-60h，每12-24h更换一次透析液。

6.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(3)中，所述离子交换层析的条件为：离子交换柱为HiTrapTMHP-Q或者HiTrapTMHP-SP；平衡缓冲液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，洗脱液为10mmol/L、pH 5.0-10.0的PBS，含1mol/L氯化钠，上样量为5.0-20mg/g柱填料。

7.根据权利要求1所述的生物防霉剂，其特征在于：在步骤(3)中，所述凝胶层的条件为：洗脱液为10mmol/L、pH 6.0-9.0的PBS，上样体积为柱体积的0.5％-5％。

8.权利要求1所述生物防霉剂，其特征在于，包括以下步骤：

按质量百分比计，称取0.5-4份成膜剂加水溶解，不断搅拌至完全溶解，配制成0.5-4.0份的溶液，再分别加入2.0-8.0份抗菌蛋白、0.5-5.0份增塑剂、1.0-4.0份交联剂，不断搅拌至全部溶解，静置去沫即得生物防霉剂。