[发明专利]单链环状文库的构建方法

说明书

本发明公开了单链环状文库的构建方法。本发明公开的单链环状文库的构建方法包括：1)利用转座酶复合体打断靶DNA，得到DNA打断产物；转座酶复合体包括转座酶、接头A和接头B，A由捕获标签、序列表中序列1的第1‑16位和转座酶的识别序列依次连接得到单链DNA和识别序列的互补序列组成；接头B由识别序列和识别序列的互补序列组成；2)对DNA打断产物进行缺口平移，解链，利用捕获标签进行捕获得到含有捕获标签的单链DNA；3)将含有所述捕获标签的单链DNA环化，得到单链环状文库。本发明的方法工艺简洁，操作简单，不需要进行末端修复、加接头、单链分离等操作，可以缩短建库周期，提高建库效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，单链环状文库的构建方法。

背景技术

全基因组测序是对未知基因组序列的物种进行个体的基因组测序。比较常见的全基因组建库是基于illumina平台或者Proton平台的双链DNA文库，其试验流程大致如下：将基因组DNA经物理或化学的方法随机打断成180-280bp的片段，末端修复和加A尾后在片段两端分别连上接头，经链式聚合酶反应(polymerase chain reaction,PCR)线性扩增后进行质检，合格即可进行测序。

单链环状文库是一种带有接头序列的闭合单链环状文库，其主要应用的平台有全基因组(Complete Genomics，CG)平台及BGISEQ-500等。目前常用的构建方法有两种：一种是常规全基因组单链环状文库构建方法，另一种是现有转座酶单链环状文库构建方法。

常规全基因组单链环状文库构建流程如图1：将基因组DNA经物理或化学的方法随机打断成150-250bp的片段，末端修复和加A尾后在片段两端分别连上接头，经PCR线性扩增后进行纯化、单链分离及环化，此方法过程复杂，耗时较长。该方法操作复杂，需要进行打断、末端修复、接头连接、PCR等操作、单链分离、经环化桥环化，实验周期较长，不利于对疾病的快速诊断和研究。

现有转座酶单链环状文库构建方法，如图2，文库构建流程为：将基因组DNA经转座酶的方法随机打断成180-280bp的片段，经扩增酶的作用进行缺口平移，然后经PCR线性扩增在片段两端分别添加上接头，然后进行纯化、单链分离及环化。转座酶是一种生物化学品，执行转座功能，通常由转座子编码，识别转座子两端的特异序列，能把转座子从相邻序列中脱离出来，再插入到新的DNA靶位点。利用其特性可以实现同时完成DNA片段化和序列插入。某些商业试剂盒，例如Epicentra公司(已被illumina收购)的Nextera试剂盒，利用转座酶同时实现DNA打断和接头的添加。此方法较简单快捷，但不利于环状单链文库。

虽然利用转座酶构建单链环状文库简便快捷，但在转座时依赖转座酶特定的19bpME(mosaic end，ME)序列，从而使得打断片段两端存在完全一样的ME序列。环状单链文库因此下游测序时，ME发生退火互补，影响测序引物的结合，使得测序质量和效率明显下降。另外该方法实验操作上还需要缺口平移和单链分离及经环化桥环化等操作。为了不浪费数据，下游测序方面还需要更换测序引物等操作，另外不方便和其他常规文库凑样，所以此方法操作方面相对繁琐且不灵活。

所以亟需一种快速构建、可以有效的避免转座酶ME序列带来的下游测序影响建库方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何构建单链环状文库。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了单链环状文库的构建方法，所述方法包括：

1)利用转座酶复合体打断靶DNA，得到DNA打断产物；

所述转座酶复合体包括转座酶和转座元件，所述转座元件由名称分别为A和B的接头组成；

所述A由名称分别为a1和c1的单链DNA组成，所述a1由捕获标签、名称序列甲的单链DNA和所述转座酶的识别序列依次连接得到，所述序列甲为序列表中序列1的第1-16位所示的单链DNA；所述c1为所述识别序列的互补序列；