[发明专利]一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法

权利要求书

1.一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：包括如下方法步骤：

(1)PEI-Fe₃O₄的制备：所述PEI-Fe₃O₄由共沉淀方法制得；

(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe₃O₄形成的复合物作为生物检测器，具体操作步骤如下：

步骤1：选择三种不同荧光FAM、TAMRA、HEX标记的三条随机寡核苷酸链和6-FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3和Free FAM dye，其中，Free FAM dye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机链和同浓度的6-FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录；

步骤2：将PEI-Fe₃O₄加入到步骤1溶液中，PEI-Fe₃O₄作为固相载体因静电作用吸附自由卷曲状态的寡核苷酸链；

步骤3：选择FAM标记的凝血酶适配体，在凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄复合物中加入凝血酶待测物进行反应；

步骤4：在含有50nM凝血酶适配体/PEI-Fe₃O₄的复合物中加入不同浓度的凝血酶，终浓度为0nM-300nM，并检测加入前后荧光值的变化，绘制标准曲线；

(3)核酸适配体/PEI-Fe₃O₄复合物对凝血酶的选择性试验及对凝血酶和溶菌酶的双通道检测试验，其中所用凝血酶和溶菌酶的浓度均为100nM；

三条随机DNA链序列：

Random 1：5’-FAM-AAAAATTATACGCGATGCGATGCGAATTAACTCAC-3’

Random 2：5’-TAMRA-TTAATTTCGCTTTTTGCGCGCAAAATTTTT-3’

Random 3：5’-HEX-CTCTGTCTGTTGCCTCCAGCGCCG-3’

凝血酶适配体序列为：TB aptamer

5’-FAM-CTCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’；

所述PEI-Fe₃O₄的制备采用经纯化和去氧的1.3M的FeCl₃﹒6H₂O和0.65M的FeCl₂﹒4H₂O在搅拌的条件下溶解在水中，用1.0M的氢氧化钠溶液调节pH，配制pH 10的月桂酸用于包被，在N₂保护下，将溶解在50％甲醇中的8％的PEI加入其中，80℃搅拌1.5h，所得修饰过的Fe₃O₄溶液分别用无水乙醇和超纯水清洗3次，最后将其溶解在20mM的pH 7.4的Tris-HCl中放于4℃保存；

所制备的PEI-Fe₃O₄纳米粒子进行TEM、DLS、XRD以及磁化强度表征，纳米粒子的粒径为10nm，水和粒径为77.9±0.18nm，Zeta电位为20.5±1.21mV。

2.根据权利要求1所述的一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：缓冲液终浓度如下：

将缓冲液配成1.5×的溶液。

3.根据权利要求1所述的利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，其特征在于：FAM标记的凝血酶适配体或50nM凝血酶适配体复合物中加入凝血酶待测物进行反应，反应体系如下：

按以上体系将各组分依次加入EP管中，共10份，混匀，30℃水浴20min，自然冷却至室温，使得DNA链吸附到PEI-Fe₃O₄表面，记录加入PEI-Fe₃O₄之后的荧光值，而后向其中分别加入不同浓度的凝血酶，终浓度为0nM-300nM，30℃水浴30min，自然冷却至室温，用荧光分光光度计分别测定荧光值，将测得的数据整理绘图。