[发明专利]一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法

说明书

本发明涉及一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶(thrombin)的荧光检测方法，提供了一种基于核酸适配体和PEI‑Fe₃O₄检测凝血酶浓度的新型生物传感器，其中寡核苷酸带负电荷，PEI‑Fe₃O₄富含氨基而带正电，在缓冲液中，荧光标记的核酸适配体与PEI‑Fe₃O₄因静电引力而吸附到Fe₃O₄的表面而使荧光猝灭。在核酸适配体/PEI‑Fe₃O₄复合物体系中加入凝血酶，凝血酶与适配体结合从而使其远离PEI‑Fe₃O₄的表面，荧光得以恢复。所以，通过荧光值的变化，可以检测出凝血酶的浓度，本发现只需要改变核酸适配体的序列，就可以实现对其他底物分子的检测，在凝血酶检测领域具有重大的研究和应用意义。

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及纳米技术，尤其是一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法。

背景技术

凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在血液凝固、炎症、贫血、创伤愈合等生理及病理过程中发挥着重要作用，其含量是凝血机制的重要指标。同时，凝血酶还可以作为相关疾病诊断的生物标识物。因此，建立简单、快速、高灵敏度检测凝血酶的方法对临床疾病的早期诊断、病程发展、疗效的监测和评估等都具有非常重要的意义。

传统检测凝血酶的方法有高效液相色谱、生物质谱法、蛋白印迹法、酶联免疫吸附分析等方法。基于色谱以及质谱技术的定量分析方法由于所用仪器昂贵、对操作者技术要求高从而缩小了其应用范围。基于免疫反应的分析方法是应用比较广泛的技术，但也存在着一些局限性，如抗体本身稳定性差(高温易失活)、抗体标记难以精确化等缺点限制了该类检测方法的应用。

核酸适配体是一类新的具有与抗体类似的识别功能的分子，它的出现为蛋白质分析带来了新的机遇和希望。近年来利用适配体作为识别分子用来建立凝血酶的检测方法逐渐被发现。利用适配体检测凝血酶的主要围绕在以光学、电化学、以及与纳米材料的作用等方面开展。适配体在光学和电化学方面的应用对靶分子虽然具有良好的线性范围，但是其检测存在灵敏度不高以及需要复杂的组装等缺点。而随着纳米材料的发展，适配体结合纳米材料成为一门新的交叉学科。采用适配体作为识别分子，利用纳米材料(碳纳米管，石墨烯等)转导放大信号，为特异、灵敏的分子识别提供了新的传感体系。本发明利用纳米材料PEI-Fe₃O₄作为载体固定适配体可以实现对靶分子的高选择性、高灵敏度、简便快速的检测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，通过荧光值的变化，检测thrombin浓度，从而只需改变核酸适配体的序列，即可以实现对其他底物分子的检测。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种利用核酸适配体和磁性材料检测凝血酶的荧光检测方法，包括如下方法步骤：

(1)PEI-Fe₃O₄的制备：所述PEI-Fe₃O₄由共沉淀方法制得；

(2)以荧光标记的寡核苷酸与PEI-Fe₃O₄形成的复合物作为生物检测器，具体操作步骤如下：

步骤1：选择三种不同荧光FAM、TAMRA、HEX标记的三条随机寡核苷酸链和6-FAM，分别为Random 1、Random 2、Random 3和Free FAM dye，其中，Free FAM dye为没有连接DNA的FAM荧光基团，分别将以上三条随机链和同浓度的6-FAM加入到缓冲液中，进行荧光检测并记录；