[发明专利]红球菌菌株YF28-1-4的诱变筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种红球菌菌株YF28‑1‑4的诱变筛选方法及应用，首先通过重离子辐照对红球菌(Rhodococcus erythropolis YF28‑1(8))基因组进行初次诱变，筛选出降解效果好的菌株再次通过超强诱变剂NTG对其进行复诱变，得到红球菌突变体库，再通过原油平板和和GC‑MS的筛选，得到转录系统和翻译系统发生突变的菌株YF28‑1‑4；本发明提供的红球菌(Rhodococcus erythropolis)菌株YF28‑1‑4具有高效的原油降解能力，同时，上述诱导筛选方法具有操作简单，周期短，效率高的优点，不仅可适用于红球菌，也适用于其他具有一定原油降解能力的微生物，具有很好的推广使用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及原油高效降解菌诱变及快速获取方法及其应用。

背景技术

原油及其副产品作为一种重要的能源物质和工业原料正在被世界各国的人们广泛开采，其在社会经济发展中具有非常广泛的作用与功能。但由于有限的技术及淡薄的环保意识，使得环境中原油污染日益严重，破坏了正常的生态平衡。仅1996-1999年间在阿拉斯加每年大概都有407起原油泄漏事故；2010年大连新港原油泄漏事件，至少污染了附近50平方公里的海域，影响范围达100平方公里。全世界每年约有800万吨石油进入环境，如何安全有效地对石油污染的水和土壤环境进行修复，降低生态风险，已成国际焦点问题。

常用的原油污染修复手段有物理法、化学法及生物修复法。近年来，物理法和化学法因为成本高，操作复杂，对设备要求高，会产生二次污染等缺点，逐渐被生物修复法代替。生物修复法是利用微生物自身的代谢来分解污染物，其最终产物是CO2、H2O等物质，不会对环境产生二次污染，所以被认为是一种绿色的处理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、化学方法不易降解的物质。

环境中主要参与烷烃降解的有细菌，真菌和酵母，目前研究发现降解活性最强，适用性最广的是细菌。目前，现代分子生物学技术发展迅速，已在诸多工业微生物菌种改造方面获得成功，但传统的诱变育种技术仍是获得优良菌株的重要手段。所以寻找一种新的高效的降解菌株的方法很有必要。

目前，研究表明原油降解基因的表达由多种转录调控因子调控。在Pseudomonasputida GPo1菌株中，在alkB基因上游的alkS基因是烷烃诱导的转录激活因子，烷烃的出现能够诱导alkB表达量升高。与以丙酮酸盐为碳源生长相比，Alcanivorax borkumensis SK2细胞以十六烷为碳源生长时，alkS基因的表达量显著提高。除了alkS基因外，还有其他调控因子参与原油降解基因的表达调控。在Alcanivorax borkumensis菌株中，alkS基因负责调控alkB1但与alkB2的表达量没有相关性，alkB2可能受其上游相邻基因GntR调控因子的调控。在A. borkumensis菌株中还有编码细胞色素P450的三个基因，AraC位于P450-1基因的上游，可能调控该氧化酶的表达。因此，从这个角度来讲，如果通过某些方法使微生物转录、翻译这些基因，这将是获得高效降解菌株的一种有效办法。

重离子辐照技术是80年代兴起的一种材料表面处理技术，由我国科学工作者余增亮首创，将重离子辐照技术应用于农作物品种改良并获得成功。在后续研究中，重离子辐照技术被逐步应用于微生物诱变育种和肿瘤治疗中。余曾亮等对重离子的作用机制总结为4方面：即能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换。这四种过程在生物体内发生的理化反应，形成的生物效应，使离子注入法育种具有许多独特的特点，这些开创性的研究工作受到国内外学术界的关注，为离子束生物工程学的发展奠定了基础，它将对生命科学中一些重大问题的研究提供技术支撑。同样，其在微生物育种中独具特色，因其损伤小、突变率高、突变谱广、诱变效果好，而受到愈来愈广泛的关注，并取得了显著的经济效益和社会效益。

NTG是亚硝基胍，是一种非常强的化学诱变剂。NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。利用重离子和NTG突变改变了原来的转录系统，从而对蛋白质翻译能力出现一定程度的改变，以提高微生物的原油降解能力。