[发明专利]一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，所述重组芽孢杆菌是通过强化表达枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。本发明通过改造枯草芽孢杆菌168获得了可高效合成合成鸟苷二磷酸岩藻糖的菌株，其胞内积累量高达156mg/L。本发明通过加强表达了糖转运蛋白基因，可以有效强化糖转运蛋白的表达，提高了外源岩藻糖转移至胞内的效率，增加了胞内岩藻糖的浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。本发明的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种合成鸟苷二磷酸岩藻 糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

母乳中含有重要营养成分，生物活性物质，刺激肠道菌群生长的因子。 其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在许多生理功能上 起到了关键的作用，例如促进双歧杆菌生长，病原体感染的抑制作用，和 提高免疫反应。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能 如其作为肠道致病菌的受体类似物的能力、促进免疫调节的能力和减少炎 症的能力，已经获得了极大的关注。因为藻糖基化的寡糖是由岩藻糖基转 移酶催化进行糖类岩藻糖基化而成，这就需要鸟苷二磷酸岩藻糖 (GDP-L-fucose)作为岩藻糖基的供体。随着岩藻糖基化的寡糖的热度越 来越高，许多制药公司试图通过化学方法和生物方法合成充足的 GDP-L-fucose。在化学合成中，GDP-L-fucose以L-岩藻吡喃糖基四乙酸 为起始原料，由HBr、Ag₂CO₃、N-四丁铵磷酸二甲苯酯等物质引发的化 学反应。GDP-L-fucose是可拉酸的前体，可拉酸是革兰氏阴性菌细胞壁的 主要成分，因此，一些肠道细菌如大肠杆菌和沙门氏菌能在体内合成 GDP-L-岩藻糖。在生物中发现了两种合成GDP-L-fucose的代谢途径：补 救途径和从头途径。

补救途径是在人类的代谢途径中发现的，外源的岩藻糖转移到胞内， 由岩藻糖激酶消耗ATP磷酸化(EC 2.7.1.52)形成岩藻糖-1-磷酸 (Fuc-1-P)。Fuc-1-P结合鸟苷三磷酸(GTP)在岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基 转移酶(L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase)(EC 2.7.7.30)的催化 下生成GDP-L-岩藻糖。从头合成途径普遍存在于原核生物和真核生物中， 其中GDP-L-fucose是由GDP-甘露糖通过甘露糖脱氢酶(GMD，EC 4.2.1.47)和GDP-岩藻糖合成酶(WCAG，EC 1.1.1.271)催化合成的。其 中有代表性的反应方法如图2所示。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要 营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe” (GRAS)安全级别。

因此，如何利用枯草芽孢杆菌，通过生物方法高效合成鸟苷二磷酸岩 藻糖，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种合成鸟苷二磷酸 岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，构建的重组枯草芽孢杆 菌可以高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖。

具体的，一方面，本发明提供了一种合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯 草芽孢杆菌，所述重组芽孢杆菌是通过强化表达枯草芽孢杆菌168的糖转 运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基转移酶基因得到的。

枯草芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因是不表达的，通过强化表达枯草 芽孢杆菌168的糖转运蛋白基因，并表达外源岩藻糖激酶和磷酸鸟嘌呤基 转移酶基因，提高了外源岩藻糖转移至胞内的效率，增加了胞内岩藻糖的 浓度，促进了鸟苷二磷酸岩藻糖的合成。