[发明专利]一种PCV2 Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法

说明书

本发明公开了一种猪圆环病毒二型Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)将PCV2GZ‑RH1株全基因克隆至pMD19‑T载体，设计引物以重组T载体为模板通过PCR技术将V5Tag或Flag Tag标签引入至PCV2的ORF2末端；(2)将携带标签的ORF2亚克隆至pFastBacHTA、pFastBacDual供体质粒，将亚克隆所得的阳性质粒转化入DH10Bac感受态细胞进行Bacmind杆粒的制备；(3)将Bacmind杆粒转染昆虫细胞，获得重组昆虫杆状病毒，重组昆虫杆状病毒扩增至P3代病毒。

技术领域

本发明涉及一种重组杆状病毒毒株的构建，也涉及了一种PCV2的Cap重组标记蛋白表达，故本发明中涉及重组杆状病毒毒株的构建及其表达的重组标记蛋白在PCV2诊断、预防中的应用，隶属生物技术领域兽医生物制品研制方面。

背景技术

猪圆环病毒(Porcinecircovirus,PCV)是一种无囊膜的小型单链环状DNA病毒，系环状病毒科、圆环病毒属成员，基因组大小在1800bp左右。根据致病性、抗原性和基因结构等的差异，猪圆环病毒一般分为圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。PCV1临床不致病，而PCV2感染可导致多种临床疾病，能引起猪只发生皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征、肉芽肿性肠炎和母猪繁殖障碍等一系列相关综合侯群，也称圆环病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)，PCVD给养猪业造成巨大经济损失。

PCV2的基因组共编码11个开放阅读框架(Open reading frames，ORFs)，其中功能上重要的是ORF1和ORF2。ORF2编码病毒的核衣壳(Cap)蛋白，是病毒的唯一结构蛋白，同时也是病毒主要的免疫原性蛋白，可以刺激机体产生中和性抗体。因此，关于PCV2基因工程疫苗的研究基本集中在ORF2基因。至今，疫苗免疫仍然是防控PCV2最主要的手段，国内市场上的疫苗主要为灭活苗，目前的疫苗所产生抗体不能与野毒抗体相区别等缺陷。为了能区分疫苗产生的抗体和野毒产生的抗体，国外的Beach和我国的黄立平等，分别将GLU、KT3标签和V5标签插入到PCV2 ORF2的末端，构建了携带分子标记的毒株，该毒株既能产生Cap蛋白又能产生标签蛋白，利用标签抗体作为检测抗体能够将标签毒株和亲本毒株区分开来(Beachetal.,2011；黄立平，2013)。然而他们在引入标签中用的融合PCR方法，至少使用了3对引物，操作过程繁琐，且耗时费力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过基因工程技术向特定基因位点引入可遗传的标记，将重组基因克隆至杆状病毒载体。其次，提供一种杆状病毒重组毒株，重组毒株在昆虫细胞中所表达的Cap标记蛋白具有良好的免疫原性，可作为PCV2亚单位疫苗和PCV2特异性抗体诊断的抗原。

本发明的技术方案是：一种猪圆环病毒二型Cap标记蛋白的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建方法，包含以下步骤：(1)将PCV2 GZ-RH1株(GenBank登录号：JQ809464)全基因克隆至pMD19-T载体，设计引物以重组T载体为模板通过PCR技术将V5Tag或FlagTag标签引入至PCV2的ORF2末端；(2)将携带标签的ORF2亚克隆至pFastBacHTA、pFastBacDual供体质粒，将亚克隆所得的阳性质粒转化入DH10Bac感受态细胞进行Bacmind杆粒的制备；(3)将Bacmind杆粒转染昆虫细胞，获得重组昆虫杆状病毒，重组昆虫杆状病毒扩增至P3代病毒。

所述的引物为引物对F2/R2；F2、R2的基因序列如Seq ID NO.4、Seq ID NO.5所示；

Seq ID NO.4：5′-GGATCCACTCAGTAATTTATTTCATATGGA-3′；