[发明专利]检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组，包括针对鸡、鸭、鹅的三重荧光PCR引物探针组，针对鹌鹑、鸽子、石鸡的三重荧光PCR引物探针组，具体如Seq.ID No.1至Seq.ID No.14所示。本发明属于基因工程检测技术领域，各引物和探针不会造成相互干扰，仅能对特定目标序列进行扩增并激发荧光信号，对非目标序列无扩增和荧光信号，可以实现对上述六种禽源性成分的准确检测，具有特异性好、标准误差小、检测时间短、节约试剂成本等优点，适于禽类产品的日常检测。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

当前，动物产品的掺假现象频繁发生，国内外屡有此类报道，例如在2013年，欧盟不少国家发生了以马肉冒充牛肉的牛肉食品掺假事件。近年来，我国也陆续曝光了很多动物产品的掺假事件，包括各地食药监、质检、工商所查获和新闻媒体公布的各类案例：以鸭肉冒充羊肉，以猪肉、鸡肉冒充牛肉，以猫肉冒充兔肉等造假手段。由于掺假动物产品绝大部分有添加香精香料、添加调味剂、已经过深加工等迷惑措施，使消费者仅通过观察和感官品评，基本不能辨别，因此食品安全问题堪忧。

在利用分子生物学技术鉴定动物产品真伪及掺假检测的方法研究中，通过PCR技术扩增并检测目标动物源性基因，是目前主流的科学依据和技术手段，近年来得到广泛的应用。该技术主要分为两个部分：①提取样品DNA；②DNA的PCR检测。

样品中DNA的提取，从操作方式可分为自动化提取，如尚未普及的自检工作站；半自动化提取，如已逐渐普及的核酸提取仪；手动提取，如当前常见的商品化试剂盒、自制试剂等。

未加工和粗加工食品的DNA损失小且较完整，上述三种方法均可适用，通常DNA纯度OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.6至1.8，浓度在ng/μL级，可略作稀释或直接用于PCR检测。

深加工食品的DNA损失大且碎片化，自动化、半自动化的方法得率较低；通常采用手动提取的方法。因为样品种类、研究方式区别很大，手动提取的方法也种类广泛、差异显著，效果因而参差不齐。

第一代PCR技术，通常称为普通PCR技术，先设计物种特异基因的引物，再将样品DNA和引物及扩增试剂混匀后通过PCR仪对目的基因进行反复扩增，然后通过电泳对扩增产物进行鉴定，从而判定是否含有该物种源性成分。

第二代PCR技术为实时定量荧光PCR，通常简称荧光PCR。除了设计物种特异基因的引物外，再设计一条荧光探针。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过实时定量荧光PCR仪(通常简称荧光PCR仪)对目的基因进行反复扩增，探针的荧光信号累积与基因扩增同步，相对普通PCR，既提升了扩增时的特异性，扩增结束后也立即获得检测结果。

多重实时定量荧光PCR(以下简称多重荧光PCR)属于荧光PCR的一种，针对多个物种特异基因，逐个设计引物和探针，不同探针分别标记上不同波长的荧光基团。将样品DNA、引物、探针及扩增试剂混匀后通过多通道荧光PCR仪对多个目的基因进行反复扩增，通过监测多个荧光信号达到同时检测多个目的基因的要求。相对普通荧光PCR，每增加一套引物和探针即可将检测效率提升一倍、并将其他试剂成本降低一倍。

中国专利数据库中涉及动物源性成分鉴定的PCR技术的专利申请件已有百余件，但多为普通PCR方法。仅有几种为多重荧光PCR方法，如20151012723.2《同时检测肉及肉制品中牛猪源性成分的Taqman-LNA多重荧光定量PCR方法及引物探针以及试剂盒》、201610272771.5《一种阿胶中驴、马、牛和猪源性巢式荧光PCR检测引物、探针、试剂盒、检测方法及应用》、201510527762.1《鉴定化妆品中驴、马及牛源性成分的引物、探针组合物、试剂盒及多重荧光PCR检测方法》等。目前，尚无文献报道对鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、石鸡的源性成分同时进行多重PCR的高效检测，因此，提供一种检测六种禽源性成分的三重荧光PCR引物探针组及相关方法具有重要意义。