[发明专利]一种快速检测β‑内酰胺类抗生素残留的方法

说明书

技术领域

本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种快速检测β-内酰胺类抗生素氯霉素残留的方法。

背景技术

β-内酰胺类抗生素(β-lactams)系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素与头孢菌素，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。此类抗生素具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效好的优点，兽医临床上广泛应用于奶牛乳房炎的防治。残留在牛奶中的β-内酰胺类抗生素，尤其是青霉素G，易导致人过敏性反应以及细菌耐药性的增加，对人体的健康造成威胁。随着其在临床上应用研究和毒理学研究的深入，由其残留问题引起的食品安全问题已引起各国食品安全管理部门及国际组织的广泛关注，因此建立牛奶等食品中β-内酰胺类抗生素残留的快速检测方法成为目前亟待解决的问题。

目前，针对β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，有微生物法、酶联免疫法、薄层色谱法、气相色谱法、气-质联用法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法和毛细管电泳-质谱法等。仪器分析法需要昂贵的仪器设备和专门的技术人员、且费用昂贵、检测时间长；微生物法存在检测灵敏度不够的缺点；酶联免疫检测法如ELISA、试纸条等具有操作简便、快速、灵敏度高、成本低等特点，适于大量样品的检测，目前备受人们的青睐。

免疫学检测方法的灵敏度高及特异性较强，但相应抗体的研发时间长而成本高，且重复性及稳定性较差。传感器方法是近些年发展起来的新型检测技术，基于生物学原理的传感器使以生物活性物质作为传感器的识别原件，与样品中的待测物质发生特异性反应，通过适当的换能器将这些反应(形成复合物、发色、发光等)转换成可以输出检测的信号(电压、频率等)，可实现对待测物的定性和定量检测。

光纤传感器是一类在物理或化学激励下产生光学特性变化，引起光纤中传播光束的特征参量，如强度、波长、相位、偏振态等的改变，并为与光纤相连接的各种检测器件所响应的装置。生物膜干涉技术基于光吸收、荧光和光反射原理，通过蛋白分子结合到传感器上的差异，导致可见光在传感器膜面上形成的干涉光谱位移差异，通过检测这种位移变化间接反映蛋白分子的浓度。因此，开发基于生物膜干涉技术的β-内酰胺类抗生素检测方法有助于快速检测动物源性食品中β-内酰胺类抗生素残留。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速检测β-内酰胺类抗生素氯霉素残留的方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种快速检测β-内酰胺类抗生素残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：制备氨苄青霉素-BSA

将氨苄青霉素钠盐溶于二甲基甲酰胺，搅拌至全部溶解后得A液；将牛血清白蛋白溶于pH值为7.4的PBS缓冲液中，搅拌至完全溶解后得B液；在搅拌条件下，将A液加入到B液中，然后向其中逐滴、均匀加入体积分数为25％的戊二醛水溶液，搅拌条件下，避光反应，所得产物用0.05M的pH值为7.4的PBS缓冲液透析，获得包被原，即氨苄青霉素-BSA偶联物；

第二步：光纤传感器抗原包被修饰

将APS光纤传感器末端没入不同浓度的包被原溶液中，室温静置5min；再将光纤生物传感器末端没入质量分数为15％的蔗糖水溶液中，室温静置1min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；

第三步：非标记检测

将氨苄青霉素-BSA偶联物用pH值为7.4的PB缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列中；将β-内酰胺类抗生素受体用巴氏杀菌奶稀释60倍，然后用该液体稀释氨苄青霉素标准品到100、50、25、12.5、6.25、3.12和1.56ng/mL，分别取200μL于微孔板的第4列中；往微孔板的第1列中加入200μL水，往第3列加入200μL巴氏杀菌奶；用APS光纤传感器探头进行检测：第一列60s，第2列60s；第3列60s；第4列300s；

第四步：金标记检测

向1mL胶体金中加入1μL 2mg/mL的β-内酰胺类抗生素受体，涡旋混匀，室温静置15min，加入100μL的质量分数为10％的牛血清白蛋白溶液，室温封闭15min，10000rpm离心10min，弃掉上层清液，加入90μL pH值为7.4的PBS缓冲液，重悬颗粒，得到金标β-内酰胺类抗生素受体；