[发明专利]一种原代人肾癌细胞的分离及培养方法在审
| 申请号： | 201711096019.0 | 申请日： | 2017-11-09 |
| 公开（公告）号： | CN109762787A | 公开（公告）日： | 2019-05-17 |
| 发明（设计）人： | 不公告发明人 | 申请（专利权）人： | 江苏齐氏生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/09 | 分类号： | C12N5/09 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 214434 江苏省无锡市江阴市东*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人肾癌细胞 肾癌组织 胰蛋白酶 差速贴壁法 成纤维细胞 完全培养基 细胞 消化 表面血管 结缔组织 器械消毒 无菌条件 细胞活性 细胞检测 细胞滤液 细胞形态 组织处理 胶原酶 培养瓶 预热的 包被 剪碎 切取 预冷 重悬 去除 成活率 剔除 接种 并用 新鲜 检测 | ||
1.一种原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）无菌条件下切取新鲜肾癌组织，4℃密封运回实验室；（2）组织处理器械消毒；（3）无菌操作台内，预冷PBS清洗肾癌组织3次，剔除表面血管、脂肪、结缔组织；（4）剪碎组织，并用预热的胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化；（5）终止消化，离心，弃上清；（6）取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；（7）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO2环境中培养；（8）差速贴壁法去除成纤维细胞；（9）细胞形态鉴定；（10）细胞存活率测定；（11）免疫学鉴定。
2.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（3）所用预冷的PBS浓度为0.01M，PH为7.2~7.4。
3.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（4）所用胰蛋白酶含0.01%的EDTA以吸收组织中的Ca2+、Mg2+，从而进一步促进细胞分离。
4.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（4）所用的胰蛋白酶浓度为0.05%~0.2%，消化时间10~20min，Ⅱ型胶原酶浓度为0.1%~0.2%，消化时间30~60min。
5.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（5）的离心速度为300~400g，离心时间5~8min。
6.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（7）所述完全培养基为含10%胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素，5μg/ml的胰岛素的DMEM/F12（1：1）培养基。
7.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（7）所述的培养瓶用3~4μg/cm2的多聚赖氨酸包被。
8.根据权利要求1所述的原代人肾癌细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（8）所用差速贴壁法的差速时间为15~30min。
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