[发明专利]用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途

说明书

本发明公开了一种用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途。所述用于诊断肝癌的试剂包含针对基因组DNA的NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中至少两个基因的含甲基化胞嘧啶的区域特异性的PCR引物对。本发明联合分析4个基因上的6个包含甲基化胞嘧啶区域作为判断肝癌发病和复发风险的生物标记物准确度远远大于单一生物标记物的检测，降低假阳性的发生。并且，本发明具有取材便利、成本低廉、灵敏度高、稳定性好等优点，能及时、精准的检测出肝癌的发病及复发风险，对早期肝癌的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在早期肝癌患者上使用的快速诊断试剂盒提供了技术保障。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种使用NEBL基因、FAM55C基因、GALNT3基因、DSE基因中的胞嘧啶甲基化程度联合诊断肝癌、肝癌发病风险、肝癌复发风险的试剂、试剂盒及检测方法与其用途。

背景技术

肝癌是一种严重威胁我国人民群众身体健康和生命安全的肿瘤。在我国，肝癌发病率位居恶性肿瘤的第二位。肝癌恶性程度很高，因为发病之初往往没有症状或症状不明显，加之肿瘤进展迅速，在确诊的时候，约70-80％的患者已经无法接受手术治疗，治疗效果很差，生存期非常短。因此，提高肝癌的治愈率，关键在于早期诊断、早期治疗。目前，国内外专家都认为，对于高危人群的监测和筛查是早期诊断肝癌的最主要的办法。我国肝癌的病因主要包括以下几个方面：(1)肝炎病毒感染；(2)长期酗酒；(3)环境因素：如食物黄曲霉毒素污染、农村饮水蓝绿藻类毒素污染；(4)其他肝脏疾病：如肝脏代谢性疾病、自身免疫性疾病、隐原性肝硬化等等。一般认为，我国的肝癌患者约90％以上均合并有乙型肝炎或丙型肝炎的感染。所以，慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎患者及长期酗酒者均是肝癌的高危人群，还有有肝癌家族史的人，都需要密切的进行监测。

一般而言，监测包含两方面：一方面是抽血化验，主要监测血清甲胎蛋白，甲胎蛋白是肝癌比较特异的肿瘤标志物，其持续升高往往意味着肝癌的发生；另一方面是影像学检查，包括肝脏超声检查、增强CT、增强核磁等检查。我们建议，对于肝癌的高危人群，最好应该每隔半年进行一次检查，首选血清甲胎蛋白检测及腹部超声检查。对于腹部超声发现的大于1厘米的肝脏结节，应该进行增强CT或增强核磁的检查来明确结节的性质，特别要指出的是，最近投入临床使用的一种叫做普美显的核磁增强剂，对于肝脏病变的诊断敏感度有很大的提高，目前在包括日本的一些国家，已经推荐普美显作为筛查肝癌的首选核磁增强剂。通过目前的免疫分析和回声测定检测出早期肝癌(直径小于3cm、直径小于5cm和单一的或高度分化的肿瘤)，并经过适当治疗，则预后相对较好。然而，用于免疫分析的现有的肿瘤标记AFP和PIVKA-II的灵敏度和特异性不够。尤其是对于早期肝癌，这两种标记的灵敏度明显很低。因此，很难检测早期肝癌，当检测到时大部分病例已经发展为晚期癌症，与其它癌症比较，肝癌患者的5年内存活率很低同时，当前在回声测定中仪器的改进使我们能够检测早期肝癌，但因为如下若干问题使其不适合筛选高风险肝癌患者：一次测定耗时30分钟左右、需要专门技能、依赖仪器性能和对普通医院的普及率较低。另外，由于很难检查整个肝，尤其是被其它器官遮住的部分和肝的内部，因此存在漏检肝癌风险。因此，仍没有足够令人满意的现有的用于检测肝癌尤其是早期肝癌的方法。

近年来，随着分子生物学的飞速发展及高通量测序技术的出现，对于表观遗传学的认知和研究也越来越多。多项研究结果表明，癌症细胞或突变的体细胞中特定基因存在高度甲基化的现象。在高等真核细胞中，基因组DNA仅在CpG二核苷酸中的胞嘧啶残基上被甲基化，富含CpG的区域称为“CpG岛”，已知其在完整的人类基因组的大约一半上存在。通常CpG岛存在于启动子区，在这种情况下甲基化与基因表达调控密切相关。简言之，在未甲基化情况下，基因可正常表达，但在甲基化情况下，通过某些调控系统的过程基因表达相反受到抑制。已知这种通过甲基化的基因表达调控对组织、发育、分化、疾病、性别或年龄具有特异性。特别地，由于在癌细胞或转化细胞中经常观察到受CpG岛上的异常的高度甲基化阻抑的基因表达，因此认为其与癌症发生有关。