[发明专利]一种羊绒、牦牛绒混合物定量检测方法

权利要求书

1.一种羊绒、牦牛绒混合物定量检测方法，其特征在于，所述方法包括：

A)制备标准混合样，取羊绒、牦牛绒制作羊绒、牦牛绒不同混合比例的标准混合样；

B)DNA提取，分别对所述不同混合比例的标准混合样进行DNA提取，分别对提取到的所述不同混合比例的标准混合样的DNA进行荧光定量PCR检测，获得不同混合比例的标准混合样中对应的羊绒的CT值Ct_cashmere以及牦牛绒的CT值Ct_yak；

C)标准曲线的建立，将得到的不同混合比例的标准混合样中对应的羊绒的CT值Ct_cashmere以及牦牛绒的CT值Ct_yak分别做差值运算，获得不同混合比例的标准混合样对应的Ct_cashmere与Ct_yak的差值ΔCt；以获得的所述不同混合比例的标准混合样对应的ΔCt为横坐标，以对应的不同混合比例的标准混合样中羊绒与牦牛绒含量的比值的对数为纵坐标取点进行曲线拟合获得所述标准曲线；

D)待检测混合物的定量检测，取所述检测混合物进行DNA提取，对提取到的所述待检测混合物的DNA进行PCR检测，获得待检测混合物中对应的羊绒的CT值Ct｀_cashmere以及牦牛绒的CT值Ct｀_yak，将获得到的Ct｀_cashmere以及Ct｀_yak做差值运算，获得待检测混合物对应的Ct｀_cashmere与Ct｀_yak的差值ΔCt｀；通过所述ΔCt｀位于所述标准曲线内的横坐标上的位置点确定其对应的所述标准曲线上的点对应的纵坐标上的点，将获得的所述纵坐标上的点进行羊绒与牦牛绒含量的比值的对数逆运算获得所述待检测混合物中羊绒与牦牛绒的比值。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A)中取直径相近的100％的羊绒、100％的牦牛绒制作5种羊绒、牦牛绒不同混合比例的标准混合样；所述羊绒与牦牛绒的混合比例分别为1:9、3:7、5:5、7:3、9:1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)中使用液氮冷冻研磨仪分别对所述不同混合比例的标准混合样进行粉碎后，分别对所述不同混合比例的标准混合样进行DNA提取。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用Promega DNA IQ^TM毛发抽提试剂盒分别对所述不同混合比例的标准混合样进行DNA提取。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述使用Promega DNA IQ^TM毛发抽提试剂盒分别对所述不同混合比例的标准混合样进行DNA提取的过程为：称取5mg标准混合样于1.5mL离心管中，加100μL DTT和75μL蛋白酶K，56℃温浴过夜；加350μL裂解液，颠倒几次混匀；瞬离，吸取上清液于新的1.5mL离心管中，加7μL完全悬浮的DNA IQTM树脂，高速涡旋振荡3s，室温温浴10min；高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上；小心去除所有溶液，加入100μL裂解液，高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上；去除所有的裂解液，加入100μL 1×洗涤液，高速涡旋振荡2s，将管子放在磁分离架上，重复洗涤3次，尽可能去除洗涤液；打开盖子，空气中干燥5min；加入70μL洗脱液，高速涡旋振荡2s，65℃温浴5min；取出管子，高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，小心吸取DNA溶液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR检测扩增所用引物及探针为根据选择的种内保守、种间差异大的基因区域所确定；所述区域为12srRNA基因区域。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR检测的反应体系与扩增条件分别为：2×Taqman universal Master Mix10μL，10μmol/L，引物各0.8μL，DNA抽提液4μL，2μmol/L，探针2.5μL，H₂O 2.7μL；95℃，10min；95℃，15s，60℃，30s，共40个循环。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C)中每种不同混合比例的标准混合样分别取4个独立样品分别进行PCR检测，取4个独立样品的羊绒Ct检测值与牦牛检测Ct值之差的平均值为ΔCt。