[发明专利]一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法

权利要求书

1.一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：

1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；

2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；

3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；

4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS基因瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS基因瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；

所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS基因瞬时表达级别：

0级 无GUS蓝色；

1级 GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；

2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；

3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；

4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS基因瞬时表达级别的最高级别；

所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mM K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O，0.1～1.0mM K₃[Fe(CN)₆]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的Triton X-100，0.5～1.5mg·mL^-1的X-Gluc。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述GUS染色液包括以下组分：38.5mmol·L^-1磷酸钠缓冲液，0.5mmol·L^-1K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O，0.5mmol·L^-1K₃[Fe(CN)₆]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的Triton X-100，1.0mg·mL^-1的X-Gluc。

3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)固态接种侵染的方法包括：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌在固体YEB平板划线活化培养至肉眼可见明显菌斑，用灭菌棉棒蘸取活化的农杆菌菌体在黄瓜子叶节伤口区域轻轻涂抹2～3次。

4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中黑暗培养的条件包括：所述黑暗培养的温度为22～25℃，所述黑暗培养的时间为1～5d。

5.根据权利要求1或4所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)共培养基以MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：1～3mg·L^-16-苄基氨基嘌呤、0.1～0.3mg·L^-1脱落酸、150～250μmol·L^-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为1～5％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述共培养基的pH值为5.0～6.0。

6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤3)乙醇溶液中乙醇的体积百分含量为90～95％。