[发明专利]一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法

说明书

本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域，包括将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌接种侵染黄瓜子叶节外植体；将侵染的外植体置于共培养基上培养；共培养后，切除外植体2/3的子叶，保留外植体的子叶节区，浸没于GUS染色液中染色、脱色；根据GUS组织化学染色部位和染色面积进行染色分级，确定归属每个GUS基因瞬时表达级别的外植体数目，得GUS基因瞬时表达指数，GUS基因瞬时表达指数值位于区间(55.56～77.77]，为敏感基因型。本发明的方法准确地评价不同基因型黄瓜对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS基因瞬时表达率难以区分不同基因型农杆菌敏感性的问题。

技术领域

本发明涉及蔬菜生物技术育种技术领域，具体涉及一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法。

背景技术

黄瓜是世界范围内重要的蔬菜作物，也是我国设施生产中重要的蔬菜作物之一，2013年我国设施黄瓜种植面积为1051万亩，仅次于番茄的1215万亩，居第二位(李天来.我国设施蔬菜科技与产业发展现状及趋势[J].中国农村科技,2016,05:75-77.)。由于栽培黄瓜自身遗传背景狭窄，抗性种质缺乏，以及与野生抗性种质资源存在远缘杂交不亲和现象，致使采用传统的杂交育种手段难以将抗病、抗虫的优异基因导入栽培种中(顾兴芳,张圣平,张思远,王长林.抗南方根结线虫黄瓜砧木的筛选[J].中国蔬菜,2006,02:4-8.)。早在上世纪八十年代末期，随着根癌农杆菌遗传转化体系的成熟应用，国外已经开始了黄瓜转基因研究。自Trulson等(1986)采用发根农杆菌感染黄瓜下胚轴诱导再生植株以来，(Trulson A J,Simpson R B,Shahin E A.Transformation of cucumber(Cucumissativus L.)plants with Agrobacterium rhizogenes[J].Theoretical AppliedGenetics,1986,73(1):11-15.)黄瓜遗传转化体系不断完善，目前已经基本建立了农杆菌介导子叶或子叶节的遗传转化体系，主要用于基因功能验证。新型的CRISPR/cas9等基因编辑技术具有定向编辑且不引入外源基因等优势，为黄瓜等作物抗病、抗逆育种打开了新的思路。基因编辑技术依赖于高效的遗传转化系统，因此，建立高效规模化黄瓜遗传转化体系，将为基因编辑技术在黄瓜育种中的应用提供基础。

黄瓜遗传转化主要采用农杆菌介导子叶或子叶节遗传转化途径，由于黄瓜遗传转化影响因素较多，特别是农杆菌介导法步骤繁琐，遗传转化效率在各基因型间差异较大(0.5％～23.0％)，限制了转基因技术在黄瓜种质遗传改良和基因功能分析方面的应用(WANG S L,Ku S S,YE X G,HE C F,Kwon S Y,Choi P S.Current status of genetictransformation technology developed in cucumber(Cucumis sativus L.)[J].Journal of Integrative Agriculture,2015,14(3)：469-482.)。传统的GUS瞬时表达率为GUS染色阳性外植体数与侵染外植体数的比值。由于GUS染色阳性外植体之间存在巨大差异，若不进行详细分类描述，难以区分出不同黄瓜品种对农杆菌侵染的敏感性差异。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，准确地评价不同基因型黄瓜材料对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率区分不出不同品种农杆菌敏感性的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：

1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；

2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；