[发明专利]一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法

权利要求书

1.一种靶向扩增果蝇miRNA前体区域的探针，其特征在于，所述探针共247对，其序列依次如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:494所示：

2.权利要求1所述探针在果蝇miRNA测序中的应用。

3.一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取果蝇总RNA，反转成cDNA；

S2.以步骤S1所述cDNA为模板，将权利要求1所述探针混合在一起成为1个pool，进行超高重PCR预扩增；

S3.再以预扩增产物为模板，将权利要求1的探针随机分为40个pool，每个pool包含5～7对探针，进行超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；

S4.将步骤S3的mmPCR产物连接特有的标签序列；

S5.将加上标签序列的样品进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；

S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述超高重PCR预扩增的反应体系为2×KAPA 2G 5μL，cDNA模板100ng，50μM探针1.25μL，超纯水补充至10μL；反应程序为95℃变性10min，95℃ 15sec，65℃ 4min循环两次，95℃ 15sec，72℃ 4min循环13次。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3所述超高重PCR扩增反应体系为芯片的左侧三列中每个孔中加2×KAPA 2G 2.5μL，20×Access Array Loading Reagent0.25μL，预扩增产物100ng，超纯水补充至5μL；芯片的右侧三列中加同等数量孔，每个孔加4μL的primer solutions；反应程序分为7步：第1步，50℃ 2min，70℃ 20min，95℃ 10min；第2步，95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环15次；第3步，95℃ 15sec，80℃ 30sec，60℃30sec，72℃ 1min，循环2次；第4步，95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环8次；第5步，95℃ 15sec，80℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环2次；第6步，95℃ 15sec，60℃30sec，72℃ 1min，循环8次；第7步，95℃ 15sec，80℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，循环5次。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述超高重PCR预扩增与步骤S3所述超高重PCR分别在特定区段富集捕获系统的两个不同部分中完成。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S1所述RNA在提取过程中及逆转录之前，分别使用DNase I酶处理RNA样品。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S5所述回收纯化为割胶回收纯化200bp～500bp的电泳产物。

9.权利要求3～8任一所述方法在定位和定量RNA修饰信息方面的应用。

10.一种用于构建果蝇miRNA高通量测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的247对探针，RNA抽提试剂，逆转录试剂，mmPCR所需试剂，Access ArrayLoading Reagent，高保真聚合酶，磁珠纯化试剂盒以及凝胶回收试剂盒。