[发明专利]一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法

说明书

本发明公开了一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法，包括如下步骤：S1.提取果蝇总RNA，反转成cDNA；S2.以cDNA为模板，用探针进行超高重PCR预扩增和超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；S4.将mmPCR扩增产物连接标签序列；S5.将加上标签序列的样品进行凝胶电泳，回收纯化电泳产物，即构建好miRNA文库；S6.将得到的多个miRNA文库混合，利用二代测序技术进行高通量测序。本发明极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法。

背景技术

2006年以来，核酸测序技术取得了革命性的突破，第二代测序技术(NextGeneration Sequencing，NGS)能够快速测定数百万个序列，在技术上实现了对一个物种的转录组和基因组进行全貌分析。特别是高通量的转录组测序技术(RNA-seq)的产生。转录组测序(RNA-seq)是利用NGS技术进行测序，全面快速地获取某一物种或特定器官、组织在某一状态下的几乎所有转录本，分析个体、组织或细胞中的全转录组、小RNA含量或基因表达谱，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。

将基于微流控技术的超高重PCR(mmPCR)与高通量测序技术相结合而产生超高重PCR测序(mmPCR-seq)是发明人于2014年在斯坦福大学发展的测序新技术，该技术能够同时扩增多达48个样本的960个位点，使这些位点的基因表达水平均一化，甚至对低含量的RNA样本都能准确定量其等位基因比例。mmPCR-seq填补了传统RNA-seq的靶向测序技术空白，该技术可用于研究转录组的等位基因变化、RNA修饰和RNA表观遗传组学研究，这一技术的发展通过降低成本而极大的扩展RNA-seq的应用领域。

但是目前的mmPCR-seq主要适用于有效构建mRNA文库测序，对于miRNA文库的构建效果不太好。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法。所述方法能够高效并完整地构建果蝇pri-miRNA上的miRNA前体区域转录组文库，极大的提高了前体miRNA上RNA编辑和修饰的检测敏感性，以及RNA靶向测序文库的均一性，缩短了构建文库和测序周期，降低了成本。

本发明的目的是提供一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种靶向扩增果蝇miRNA前体区域的探针，所述探针共247对，其序列依次如SEQID NO:1～SEQ ID NO:494所示。

本发明自主合成的特异性探针可对miRNA进行靶向扩增，扩增区域包括pri-miRNA上覆盖miRNA前体(pre-miRNA)的区域，是下一步结合mmPCR-seq技术发展新技术的前提。

因此，上述探针在果蝇miRNA测序中的应用亦在本发明保护范围内。

具体地，所述应用为上述探针在构建果蝇miRNA高通量测序文库中的应用。

一种构建果蝇miRNA测序文库进行高通量测序的方法，包括如下步骤：

S1.提取果蝇总RNA，反转成cDNA；

S2.以步骤S1所述cDNA为模板，将上述247对探针混合在一起成为1个pool，进行超高重PCR预扩增；

S3.再以预扩增产物为模板，将上述247对探针随机分为40个pool，每个pool包含5～7对探针，进行超高重PCR扩增样品中的miRNA，同时在扩增产物两端分别接上3'接头和5'接头；