[发明专利]传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.32fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

传染性皮下及造血组织坏死性病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV）是引起对虾传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis，IHHN)的病源，也就是引起慢性矮小残缺综合症(Runt-deformity syndrome , DRS)的病原。该病于1981年首次在美国夏威夷地区的一个养殖场中发现，最先爆发于细角滨对虾（L. stylirostris）中，随后的调查发现在亚洲和美洲养殖的对虾中也广泛存在。该病对幼虾的危害尤其严重，其影响整个对虾养殖业的发展。世界各地爆发的疫情显示，IHHNV对细角滨对虾（L. stylirostris）造成高达90%的死亡率，对凡纳滨对虾（L. vannamei）、斑节对虾（P. monodon）、日本囊对虾（M. japonicus）则引起矮小畸形症候群（Runt-deformity syndrome， RDS），受感染的对虾永久性长不大，养殖产量大大降低，造成的经济损失是不可忽视的。感染了IHHNV病毒却存活下来的细角滨对虾（L. stylirostris）和滨凡纳对虾（L. vannamei）都会终身携带该病毒并且可以传播给下一代或者死亡后被其他健康虾当做食物，导致其后代感染该病毒，形成垂直传播。目前该病没有任何有效的治疗方法，因此，早期检测筛选虾苗和养殖过程中实施规律性诊断是唯一的有效途径。2003年， OIE将IHHN疾病划为须向其申报的甲壳类重要疾病之一。

目前，有关IHHNV的检测方法主要有 5种，第一种是电镜观察法，第二种是HE染色法，第三种是抗体检测法，第四种是核酸探针杂交法，第五种是PCR检测法。电子显微镜计数虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但操作复杂、耗费时间长、成本高。HE染色法基于病理学计数，不能直接对病毒进行检查，只能利用发病的组织病理征兆进行检测。抗体检测法和核酸探针杂交法是对病毒本身的蛋白质或核酸成分进行检测，其检测灵敏度较低，耗时长，只能用于发病对虾或即将发病的对虾进行检测；IHHNV尚未引发感染或在感染极早期很难用以上的方法检测。IHHNV的PCR检测法，虽然客服了前四种方法的缺点，在实验室条件下能够实现对IHHNV的相对快速准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪器、凝胶电泳和成像系统，且检测时间长，也大大限制了PCR检测方法在实际中的推广应用。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测对虾传染性皮下及造血组织坏死性病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。