[发明专利]一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用，属于分子生物学领域。本发明以groEL基因为筛选标记，可实现高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的双歧杆菌组成，并且可以达到亚种水平，分辨率高于16S rRNA。通过基于groEL基因的特异性引物扩展，与传统的16S rRNA方法相比，将双歧杆菌属水平的鉴定周期至少缩短1天时间。本发明的方法能够100％鉴定双歧杆菌，对种和亚种的鉴定准确率达100％。

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序的双歧杆菌快速检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

双歧杆菌作为人和其它一些动物肠道内重要的益生菌，备受工业界和学术界专家学者的关注。双歧杆菌不仅能抑制肠道中致病菌的生长进而调节和改善肠道菌群，双歧杆菌还能改善乳糖不耐症、降低血清胆固醇、促进免疫和发挥抗氧化等重要益生作用。大量国内外微生态学研究表明，双歧杆菌还具有抑菌、防癌、营养等多种功效。因此，研究人体以及其它动物肠道内的双歧杆菌显得尤为重要。但是，迄今为止，国际国内尚无统一的可将双歧杆菌菌株准确鉴定至种水平的方法。

随着双歧杆菌菌株在益生菌制剂方面越来越广泛的应用，双歧杆菌菌种的鉴定越发显得重要，甚至需要鉴定至种的水平。细菌传统的鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化等特性进行的，由于双歧杆菌形态的多变性以及专性厌氧和营养要求的复杂性，采用糖发酵等方法往往无法将性状相近的双歧杆菌菌种区分至种的水平。随着近年来分子生物学的发展，采用分子生物学方法对双歧杆菌进行属、种水平鉴定已有较大进展。目前的双歧杆菌分子生物学检测技术主要可包括三大类：(1)基于特异性核酸前体或探针的直接检测鉴定；(2)基于分子标记技术的检测鉴定；(3)基于PCR相关技术的检测鉴定。

以16S rRNA基因为基础的高通量测序技术具有简便和快速的特点，从而为肠道中双歧杆菌的检测提供了可能，然而，16S rRNA基因在区分不同种双歧杆菌方面还存在分辨率较低的局限性，因此该方法还不能满足双歧杆菌种及亚种水平的检测。这在一定程度上限制了双歧杆菌的研究，从而影响了双歧杆菌的工业应用。

发明内容

为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明选取groEL基因，以该基因为基础设计引物，通过高通量测序技术在种及亚种水平进行双歧杆菌的检测和鉴定。该方法可用于快速、灵敏和特异地检测复杂样品中不同种及亚种双歧杆菌的组成。

本发明的一个目的是提供一种鉴定双歧杆菌种的方法，所述方法是以groEL基因为标记物进行鉴定。

在本发明的一种实施方式中，所述方法以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，对标记物基因groEL的序列进行扩增，能够成功扩增获得目的条带的即为双歧杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物基因片段的大小为400～600bp。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是对含有微生物基因组的对象进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述对象包括基因组DNA、菌悬液、或单菌落。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以含待测混合物的基因组DNA为模板进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以单菌落为模板进行扩增。

本发明的第二个目的是提供一种鉴定复杂样品中双歧杆菌亚种水平组成及含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)构建双歧杆菌groEL基因标准文库；(2)以SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，对复杂样品基因组中groEL基因序列进行扩增；(3)将扩增结果回收、建库，并通过Miseq测序；(4)将测序结果与双歧杆菌groEL基因标准文库比对，鉴定、分析复杂样品中双歧杆菌亚种水平的组成特征。配合16S rRNAV3-V4区物种多样性分析方法，可以用于测定样品中双歧杆菌各个亚种的含量。