[发明专利]用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法

权利要求书

1.一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接，所述连接序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:6任意一条核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列还可设置于标签的3’端，构成连接标签，通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接。

3.根据权利要求1或2所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列用于Ion torrent测序平台。

4.根据权利要求1或2所述的用于多重PCR文库构建的连接序列，其特征在于：所述连接序列适用于人核酸测序文库构建。

5.如权利要求1～4任一项所述的连接序列的设计方法，包括如下步骤：

获取候选序列集：采用滑窗法构建人类远源物种基因组核苷酸序列集N和人类基因组核苷酸序列集M，将序列集M中出现的序列从序列集N中剔除，获得候选序列集；所述人类远源物种选自Exophiala mesophila、Photobacterium profundum、Borrelia miyamotoi、Neomicrococcus aestuarii；

候选序列初筛：在候选序列集中，筛选满足以下条件的序列：

（1）解链温度为55～65℃的序列；

（2）不包含未知碱基的序列；

（3）与序列自身、测序接头不形成二聚体的序列；

e-PCR复筛：将初筛获得的序列对人类参考基因组进行e-PCR分析，筛选不生成模拟扩增产物的序列作为连接序列。

6.根据权利要求5所述的设计方法，其特征在于：获取候选序列集时，滑窗法以15～20bp为窗口大小，1bp为步长，扫描相应的参考基因组。

7.根据权利要求5所述的设计方法，其特征在于：筛选与序列自身、测序接头不形成二聚体的序列的方法为：利用primer软件，将候选序列集中的各条序列分别与序列自身、测序接头进行二聚体分析，剔除能够形成二聚体的序列。

8.权利要求1～4任一项所述的连接序列、利用权利要求1～4任一项所述的连接序列构成的连接引物、连接接头、连接标签在人核酸测序文库构建及制备人核酸测序试剂盒中的应用；其中，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列设置于测序接头的3’端，构成连接接头；所述连接序列设置于标签的3’端，构成连接标签。