[发明专利]用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法

说明书

本发明公开了用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法。基于本发明的连接序列能通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接，其设计方法包括：获取候选序列集、候选序列初筛、e‑PCR分析；本发明的连接序列排除了与扩增体系中其他序列的相互干扰，构建的文库质量好，并且通用性强，不仅适于一步和两步扩增建库，还适于多种核酸测序文库的构建，如检测遗传性耳聋致病位点、苯丙酮尿症致病基因、肺癌靶向用药基因、乳腺癌BRCA1/2突变基因、安全用药基因的测序文库，基于连接序列的文库构建简化了建库流程，大大节约测序成本，还可应用于核酸测序试剂盒中，具有非常良好的市场应用前景。

技术领域

本发明属于高通量测序领域，更具体地涉及用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法。

背景技术

核酸测序已经成为生物学研究、疾病筛查、医学辅助诊断中不可缺少的一项重要技术，从根本上改变了人类研究生命蓝图的方式。高通量测序是目前主流的核酸测序方法，其具有费用低、通量大、速度快的优势。现有的高通量测序平台主要包括Illumina公司的Solexa测序平台、Roche公司的454平台、Life公司的Ion torrent平台。

随着测序平台硬件及软件的提升，阻碍高通量测序技术发展的却是文库构建以及后续的数据分析。其中，所有测序平台都涉及复杂的文库构建过程，一方面需要捕获目标片段，另一方面还需要将平台配套的测序接头和区分样本的标签连接到捕获片段上。以基于多重PCR捕获的文库构建过程为例，基础方法包括如下步骤：(1)多重PCR捕获目的片段；(2)引物和/或修饰清除；(3)测序接头和/或标签连接；(4)磁珠纯化；(5)PCR扩增富集。在此基础流程上做出的改进主要有：(1)测序接头和标签的连接与PCR扩增合并为一步；(2)多重PCR捕获目标片段与测序接头和/或标签连接合并为一步；(3)无引物和/或修饰清除步骤，(4)以上情况的组合等等，其主要目的都是简化流程，节约成本。文库构建过程的简化并非易事，每个步骤的改进或去除都会影响文库构建的质量，如文库浓度，文库片段分布，进而影响扩增子均一性、数据利用率等。此外，更不容忽视的是，PCR测序文库构建过程中，涉及的反应序列复杂多样，如特异性引物序列、测序接头序列、多个标签序列等等，如何在建库步骤中排除或降低序列之间的相互干扰，获得良好的文库质量，并且兼顾序列的通用性，是需要设计者有创造性地去设计和改进才能实现的。

发明内容

基于背景技术谈及的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于多重PCR文库构建的连接序列及其设计方法；还提供以上连接序列和基于连接序列构成的连接引物、连接接头、连接标签在核酸测序文库构建和制备核酸测序试剂盒中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于多重PCR文库构建的连接序列，所述连接序列设置于目标片段特异性引物的5’端，构成连接引物；所述连接序列还设置于测序接头的3’端，构成连接接头；基于连接序列的设置，通过PCR扩增实现目标片段与测序接头的连接。

作为上述连接序列的改进，所述连接序列还可设置于标签的3’端，构成连接标签，通过PCR扩增实现标签、测序接头、目标片段的连接。

作为上述连接序列的优选，所述连接序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7任意一条核苷酸序列。

作为上述连接序列的优选，所述连接序列用于Ion torrent测序平台。

作为上述连接序列的优选，所述连接序列适用于人核酸测序文库构建。

如上所述的连接序列的设计方法，包括如下步骤：

获取候选序列集：采用滑窗法构建人类远源物种基因组核苷酸序列集N和人类基因组核苷酸序列集M，将序列集M中出现的序列从序列集N中剔除，获得候选序列集；

候选序列初筛：在候选序列集中，筛选满足以下条件的序列：