[发明专利]结合时间分辨荧光技术的微流控芯片及其制备方法和应用

说明书

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种结合时间分辨荧光技术的微流控芯片及其制备方法和应用。本发明的结合时间分辨荧光技术的微流控芯片包括加样区、过滤区、时间分辨荧光微球抗体或抗体复合物结合区、微混合器、反应区和废液区。该微流控芯片采用时间分辨荧光纳米颗粒标记抗原或抗体，光稳定性强，灵敏度高，能有效避免样品自身的干扰；微流控芯片上可同时标记多个待检测项目的抗原或抗体，因而能实现单一样品的多个项目同时检测，提高效率，节约样品成本和时间成本；该微流控芯片的制备方法简单，在检测中精确性高，保证了批间差异小，稳定性高，通过检测荧光强度可实现样品的全定量检测。

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种结合时间分辨荧光技术的微流控芯片及其制备方法和应用。

背景技术

目前体外诊断产品(in vitro diagnostic products,IVD)市场上的检测试剂盒大都是利用抗原和抗体特异性结合的原理，用不同的荧光素作为标记抗体或抗原，与固定相的抗体或抗原，特异性的和待检测样本中的抗原或抗体，形成复合体，最后检测复合体的荧光强度来完成测定样本中待测物的浓度。但是这种普通的荧光素(如FITC、Alexa Fluor647等)存在着stock位移小，激射光和发射光不容易区分，需要特殊的窄带滤波片来区分激发光和发射光，滤波片一方面降低了光强，一方面增加了成本。同时这些荧光素很容易被光漂白，荧光强度弱等问题，造成了这些检测试剂盒的灵敏度不高，稳定性不强的问题。

时间分辨荧光免疫分析(Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术，它把镧系元素和配基结合起来形成螯合物，这些螯合物的发光特点，荧光寿命较长，可达1～2ms，同时有很强的荧光效率，能够满足测量要求。时间分辨荧光分析法，是关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

目前市场上产品均是采用解离增强镧系元素荧光免疫分析(DissociationEnhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay,DELFIA)是时间分辨荧光分析中的一种。它采用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu3+)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成Eu3+标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此需加入一种解离增强液，首先把Eu3+从复合物上解离下来，然后自由Eu3+与解离增强液中荧光增强物(螯合剂)螯合进入胶束的疏水内核，使Eu3+的荧光成行万倍增加。采用这种解离增强步骤分析方法，被称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

当前时间分辨荧光在IVD领域的应用主要还集中在纸层析法，纸层析法的最大缺点在于由于载体层析纸很难做到孔径以及分布的均一性，因而不能主动控制流速；由于每一张层析纸不能完全做到可重复，因而批次间检测结果也存在极大的不可重复性；此外，纸层析法更没办法做到单一样品的多通道检测。

随着微流控技术的发展，越来越多的微流控芯片被应用在IVD临床检测领域。微流控芯片结构的精密性及可重复性保证了微流控芯片批间差异小，结果可重复；其微通道保证所需样本量极少，只需微升级别的样品；同时其通道的分布可以保证在单一芯片上完成多种项目的同时检测，大大提高了检测效率。但目前市面上临床检测领域的微流控芯片还主要是普通的荧光素与检测抗原或抗体相标记后检测待检样品。目前并没有在微流控芯片上运用时间分辨荧光来完成检测的微流控免疫芯片。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合时间分辨荧光技术的微流控芯片，该微流控芯片采用时间分辨荧光纳米颗粒标记抗体或抗原，灵敏度高，能有效避免样品自身的干扰，能实现单一样品的多个项目同时检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：