[发明专利]一种检测病毒多种分型的方法和检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测病毒，特别是人乳头瘤病毒多种分型的方法和检测试剂盒。所述方法包括以下步骤：1)确定病毒及其不同亚型；2)对病毒的不同亚型设计特异性引物和探针；3)设计一个或多个筛选组合及其对应的分型组合；4)通过设计一个或多个筛选组合确定待测样本的病毒亚型所属的亚组；5)通过与筛选组合对应的分型组合确定病毒的具体分型。所述方法及试剂盒灵敏度高，特异性强，可以一次检测多种常见高低危类型的病毒，大大提高了病毒的检测效率，缩短检测时间。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及采用多种荧光标记的多重核酸扩增的荧光检测方法及检测试剂盒。

背景技术

随着人类对基因组的逐步探索，细菌与病毒基因组的差异分成多种亚型，人类基因组的多态性被发现。针对病毒、细菌不同亚型或人基因组多态性的细致分析，有利于疾病的进一步治疗。病毒分型如人乳头瘤病毒分型、流感病毒分型、乙肝病毒分型、丙肝病毒分型等，对不同病毒基因型研究，对分子流行病学调查、临床诊治过程中出现的基因变异、对抗病毒治疗的反应和病情预后评估等方面都具有重大意义。

例如，病毒中的人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)是属于乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，是对皮肤及黏膜上皮细胞具有特殊嗜性的一类小DNA病毒。完整的病毒颗粒为一个感染单位，外形呈20面体对称型，外壳有72个衣壳体，直径约45-55nm，相对分子质量5×l0⁶。HPV基因组为环状双链DNA，含有近8000碱基对(bp)，由3个部分组成，包括早期区(early region，E)含有E1、E2、E4、E5、E6和E7共6个基因，是维持病毒复制、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因；晚期区(late region，L)和长控制区(longcontrol region，LCR)。

HPV是一类具有严格宿主范围和组织特异性的病毒，主要感染人的皮肤或黏膜上皮细胞，引起感染部位发生病变。宫颈癌是女性生殖道最常见的恶性肿瘤之一。已有的研究表明，高危型人乳头瘤病毒持续感染及多重感染是导致宫颈癌变的重要原因之一。宫颈癌是一个由癌前病变逐渐衍变为癌的连续性病理过程。通常为宫颈上皮内瘤样变I-II-III-宫颈原位癌-宫颈早期浸润癌-宫颈浸润癌。已有的研究表明，90％以上的宫颈癌标本中有HPV DNA的存在。HPV具有致癌危险性，感染生殖道和肛门的HPV分为低危型和高危型。高度致癌危险的病毒主要包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、56、66等亚型。通常在高度鳞状上皮内病变中发现。低度致癌危险的病毒主要包括HPV6、11、42、43、44、53、61等亚型。一般伴随尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变极少引起浸润癌。

目前检测基因分型方法较多，包括如DNA直接测序，基因芯片也称为DNA微列阵(DNA microarray)，原位杂交技术、液态悬浮芯片技术等。

DNA直接测序为基因检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，通量低，不适合快速检测。

基因芯片是指采用原位合成或直接点样的方法将大量DNA片段或寡核苷酸片段排列在硅片、玻璃等固体介质上形成微矩阵。样品核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的各点同时进行杂交，通过检测杂交信号的强度而获取样品分子的数量和序列信息，从而对基因序列及功能进行研究。基因芯片的优点是：(1)利用其高通量特性达到对某种基因亚型的同步检测和筛查，具有简化检测步骤、缩短检测时间、降低患者检测费用等优势；(2)具有病毒检测与分型同时进行的优点，对高度CIN预测虽敏感性较HCII法差，但特异性、准确性、阳性预测值和阴性预测值均很高，一次可检测多种亚型的病毒亚型，其结果可协助临床诊断。其局限性在于：(1)由于其敏感性较HCII法差，用于筛查尚存在一定的漏诊率，还有待于大样本临床实验的验证；(2)样品的PCR处理，不可避免地带来PCR所具有的问题；(3)检查价格昂贵，很难投入临床实际应用。