[发明专利]一种自身免疫性肝炎模型及利用该模型筛选的药物

说明书

技术领域

本发明涉及一种非人动物模型,具体是一种自身免疫性肝炎模型的建立及利用该模型筛选到的药物醋酸格拉替雷在制备治疗自身免疫性肝炎的药物中的用途。

背景技术

自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis, AIH）是由于自身免疫系统紊乱，引起病理变化以及功能紊乱，导致免疫细胞直接或间接攻击肝实质细胞，而产生自身抗体，造成肝脏损伤的炎症疾病，但是其详细的病理机理仍然不清楚。目前其治疗方案有限：免疫抑制治疗及肝脏移植。治疗药物可以分为标准治疗和选择性治疗。标准治疗为强的松龙联合或者不联合咪唑硫嘌呤，1950～1960年，发现皮质类固醇和咪唑硫嘌呤具有较好的效果，但是皮质类固醇有严重的负作用（主要是库氏综合征样变化，骨质疏松症，糖尿病，白内障，高血压，精神病等），咪唑硫嘌呤的负作用主要是血球减少、血细胞中巯基嘌呤甲基转氨酶的活性低。由于药效不明显或者药物的毒副作用导致病人无法继续用药，后期发展了选择性治疗；1970～1980年代，他克莫司和环孢霉素作为选择性免疫抑制药钙调磷酸酶抑制剂，对于皮质类固醇治疗不敏感的病人可以使用，它们的毒效副作用是高血压，肾功能缺陷，高血脂，多毛症，感染以及其它的恶性疾病；霉酚酸酯，英夫利昔，布地奈德也经常被用为选择性药物，但仍然有毒副作用。虽然以上药物可以对80%以上病人有明显的疗效，但是长期使用这些免疫抑制，即使是低剂量，其副作用非常明显，而当药物停用后，70-80%的病人会复发，且有15-20%对现有药物治疗效果不明显。当病情发展为肝脏衰竭，或者爆发性肝炎则不能进行免疫抑制治疗，必须考虑肝脏移植。如果不进行治疗，大约50%的病人会在5年内死亡。

目前大约有7种研究AIH的模型，肝脏匀浆免疫法、替代抗原（Con A/α-GalCer）免疫法、抗原/TCR转基因法、负载抗原的DC细胞免疫法、利用分子相似性的病毒感染法、特定基因敲除法、AIH抗原免疫法，这些都是对免疫抑制剂敏感模型，不能反映临床上15~20%对于传统疗法不敏感的病人。因此，建立新AIH模型，对更全面地研究AIH的发病机理，开发新的疗效确切的药物非常迫切并具有重要意义。

醋酸格拉替雷，英文名称为Glatiramer acetate，是一种传统用于治疗多发性硬化症的多肽混合物，它由丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和酪氨酸组成的随机聚合物，平均分子量大小约为4700~11000道尔顿，结构式为(Glu, Ala, Lys, Tyr)_x·xCH₃COOH。醋酸格拉替雷的合成方法已经在美国专利 3849550，5800808，5981589，6048898，6054430，6342476，6362161等中进行了描述。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的小鼠自身免疫性肝炎模型，该模型可以作为对传统免疫治疗不敏感的自身免疫性肝炎病人的模型，研究疾病发生机理，并筛选药物。本发明的另一目的是提供经过该模型筛选获得的药物醋酸格拉替雷在制备治疗肝炎，尤其是治疗自身免疫性肝炎的药物中的新用途。

实现本发明目的的技术方案是：

在第一方面，本发明提供了一种小鼠自身免疫性肝炎模型的制备方法，包含如下步骤：

（1）AAGL的制备：

a）将茶树菇用ddH₂O浸泡，浸泡液利用硫酸铵沉淀法，透析得到总蛋白；然后利用lactose-Sepharose 6B的亲和层析柱得到目的蛋白AAGL，AAGL在ddH₂O中透析过夜，透析液冻干（ Biochemical Journal, 2003 (374): 321-327）；

或者b）重组表达：将AAGL的编码cDNA序列克隆到表达载体，转入大肠杆菌中，进行表达，用lactose-Sepharose 6B亲和纯化或者用标签亲和纯化。（Protein and Peptide Letters. 2005, 12(7):705-7.）。

（2）将AAGL的冻干粉末用PBS溶解，配成0.25 mg/ml的浓度，用0.22μm的滤器过滤后，按照小鼠体重尾静脉注射到C57BL/6小鼠中，3小时以后可以检测到ALT（谷丙转氨酶）和AST（谷草转氨酶）有显著增加，一直到12小时后ALT和AST缓慢下降，至24小时恢复正常水平；6-9小时是检测肝炎症状的最佳时间。

优选地，所述自身免疫性肝炎的症状包括：