[发明专利]提高牛体细胞克隆胚和体外受精胚的发育质量的培养液和培养方法

说明书

技术领域

本发明属于家畜胚胎工程领域，具体涉及一种牛体细胞克隆胚和体外受精胚的培养液及培养方法。

背景技术

家畜胚胎体外培养是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到胚胎体外移植、动物基因编辑育种及优良家畜品种扩增等方面。但至今牛的体外胚胎发育质量相对于牛的体内胚胎仍然不高，主要体现在获得的囊胚少、形态差、囊胚的细胞数目少、凋亡细胞数目多、妊娠率低下、妊娠时间增长、出现巨胎，及出生性别比失衡等情况，因此，显著制约着此技术的广泛应用。

Knockout serum replacement(KSR)是一种已知成分的无血清营养物质，在人类和小鼠胚胎干细胞培养时，能够使胚胎干细胞维持良好状态，并促进干细胞进行增殖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高牛体细胞克隆胚和体外受精胚的发育质量的培养液和培养方法，能够提高牛体细胞克隆胚和牛体外受精胚的发育率和发育质量。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种提高牛体细胞克隆胚和体外受精胚的发育质量的培养液，该培养液包括mSOFaa 液，所述mSOFaa液包括SOF(合成输卵管液)基础培养基以及添加物，SOF基础培养基包括体积分数为0.28～0.285％的乳酸钠及30～35mg/L的丙酮酸钠，添加物包括 4～8mg/mL的BSA。

优选的，每100mL SOF基础培养基具体包括0.6294g的NaCl、0.0534g的KCl、0.162g 的KH₂PO₄、0.0172g的CaCl₂·2H₂O、0.00996g的MgCl₂·6H₂O、0.2106g的NaHCO₃、 0.003～0.0035g的丙酮酸钠以及28～28.5μL的乳酸钠；所述添加物具体包括BME(Basal Eagle Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)、谷氨酰胺、BSA(牛血清白蛋白)、庆大霉素及头孢霉素，其中，BME的体积分数为2％，MEM的体积分数为1％，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，BSA的浓度为4～8mg/mL，庆大霉素的浓度为50μg/mL，头孢霉素的浓度为50μg/mL。

一种提高牛体细胞克隆胚和体外受精胚的发育质量的培养方法，包括以下步骤：

将牛克隆重组胚、牛体外受精胚或者处于一定胚胎发育时期(胚胎发育时期可以是例如，2-细胞时期至囊胚期之间的任意一个胚胎发育时期)的自体外获得的牛胚胎置于上述 mSOFaa液中进行培养；牛克隆重组胚、牛体外受精胚培养至第78～100h，或者，所述牛胚胎已经发育至2-细胞时期之后，则向mSOFaa液中加入血清替代物，然后继续培养， mSOFaa液中添加的血清替代物的体积分数为1～10％。

优选的，所述血清替代物选自KSR(KnockOut^TMSerum Replacement)。

优选的，所述培养方法具体包括以下步骤：将500μL上述mSOFaa液加入至培养容器(例如四孔板)中后用石蜡油覆盖液面，然后将30～40个牛克隆重组胚或牛体外受精胚置入该培养容器中，然后在38.5℃、5％CO₂、7％O₂以及饱和湿度条件下进行培养，培养至第96h时向所述培养容器中加入KSR，mSOFaa液中添加的KSR的体积分数为5％，然后继续培养至第8天。

所述牛克隆重组胚是通过将牛供体细胞移入去核的卵母细胞并完成融合及激活而得到的。

所述牛体外受精胚是通过将牛精子和牛卵子在体外人工控制的环境中受精而得到的。

本发明有益效果体现在：

本发明提出了一种改良的mSOFaa液配方，其通过控制乳酸钠、丙酮酸钠及BSA等关键组分，相比一般商用的胚胎培养液(诸如SOFaa、KSOMaa等)具有更好的培养效果，可以提高牛胚胎体外发育质量。

进一步的，本发明通过在mSOFaa液中增加体积分数为1～10％的血清替代物(特别是KSR)，显著提高了牛胚胎的体外发育率、囊胚质量及囊胚细胞数。

进一步的，KSR于胚胎发育至2-细胞时期之后(大约就是受精胚或重组胚于培养条件下发育78～100h左右)再加入培养体系中，从而能够发挥KSR作为胚胎营养素因子的积极作用，高效率的获得牛体细胞克隆胚胎或体外受精胚胎。