[发明专利]用汉逊酵母表达系统产生HPV6L1蛋白的方法

说明书

本申请为申请日为2012年3月28日、申请号为201210088620.6、发明名称为“用汉逊酵母表达系统产生HPV6 L1蛋白的方法”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明属于医药生物工程技术领域，涉及产生HPV6 L1蛋白的方法，尤其涉及用汉逊酵母表达系统产生HPV6 L1蛋白的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒，属乳多空病毒科多瘤病毒亚科，主要侵犯人体的上皮黏膜组织，进而诱发各种良性及恶性增生病变。

目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种，HPV感染具有明显的组织特异性，不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同，能诱发不同的乳头状病变，大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关，其中有20多种与肿瘤相关。根据HPV诱发病变的良恶性不同，HPV可大致分为两类：1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV45、HPV31、HPV33、HPV52、HPV58、HPV35、HPV59、HPV56、HPV39、HPV51等)：与人类多种组织恶性肿瘤密切相关，主要引起重度不典型增生和浸润癌，尤其以HPV16及HPV18型感染与宫颈癌的发生最为密切，这两个型别感染占宫颈癌感染的70％以上，其中HPV16占50％以上；2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV 81等)：可引起表皮细胞良性增殖性性病，如尖锐湿疣和扁平湿疣等，其中由HPV6与HPV11诱发的尖锐湿疣占90％以上。

HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp，有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达，称为早期蛋白；2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达，称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2，并参与病毒外壳的形成。

HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装，在多种表达系统中单独表达的L1蛋白或将L1蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)，其中以在酵母系统、杆状病毒昆虫表达系统及哺乳动物细胞表达系统等产生的VLP更接近天然病毒的结构。利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体，获得良好的免疫保护效果。

多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)，又称作Pichia augusta，是当前公认的最为理想的外源基因表达系统之一。多形汉逊酵母作为单细胞真核微生物，既具备原核生物生长快速、易于遗传操作等特点，又有真核细胞翻译后加工和修饰等功能。此外，汉逊酵母还具备安全性好、易于培养、成本低廉、表达量高及遗传稳定等优势，并且能够克服诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株不稳定、产量低及糖基化侧链过长以及毕赤酵母(Pichia Pastoris)外源基因整合拷贝数较低的问题。目前，应用汉逊酵母表达系统生产的药物(如胰岛素，商品名Wosulin)及HBV疫苗(商品名Hepavax-Gene)均已上市销售。

发明概述

在第一个方面，本发明提供了一种产生表达HPV6 L1蛋白的重组汉逊酵母细胞的方法，其包含以下步骤：

a)通过将包含编码HPV6 L1蛋白的核苷酸序列的外源多核苷酸插入载体来构建表达构建体；

b)用步骤a)中获得的表达构建体转化汉逊酵母细胞；和

c)对步骤b)中获得的汉逊酵母细胞进行筛选，获得含有所述外源多核苷酸的重组汉逊酵母细胞。

在第二个方面，本发明还提供了根据上述方法产生的重组汉逊酵母细胞。

在第三个方面，本发明还提供了一种产生HPV6 L1蛋白的方法，包括以下步骤：

i)在适于HPV6 L1蛋白表达的条件下培养本发明的重组汉逊酵母细胞；和

ii)从培养物中回收并纯化HPV6 L1蛋白。

所述方法还可以包括对所纯化的HPV6 L1蛋白进行解聚和重聚的步骤。

在最后一个方面，本发明还提供了根据本发明的方法产生的HPV6 L1蛋白在制备用于预防HPV6感染的疫苗中的用途。

附图说明