[发明专利]硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

1）重组载体：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶蛋白基因和分子伴侣蛋白GroES基因，获得两个单独表达的蛋白基因；然后连接所述两个蛋白基因到同一个表达载体pET15b，使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接获得重组载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白具有单独的启动子获得重组载体pET-GroES-T7-ChSase ABCI；其中，所述分子伴侣蛋白GroES基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述硫酸软骨素ABC酶蛋白来源于普通变形杆菌；

2）获得转化体：将所述步骤1）得到的所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的转化体；以及

3）制备硫酸软骨素ABC酶蛋白：培养所述步骤2）得到的所述转化体，并进行物理破碎处理，制得所述硫酸软骨素ABC酶蛋白；其中，以硫酸软骨素A为底物时，所述硫酸软骨素ABC酶融合蛋白酶活为50.65～206 IU/mL粗酶液，且最终产量达到35000～61800 IU/L发酵液。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2）包括将所述步骤1）得到的两种所述重组载体分别转化到所述宿主细菌中进行表达。

3.根据权利要求2所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中的所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或DH5α。

4. 根据权利要求3所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3）培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25mM的IPTG在10℃～42℃诱导培养15～28小时。

5. 根据权利要求4所述的硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中培养所述转化体的条件为采用LB培养基在37℃培养所述转化体3小时，加入终浓度为0.25 mM的IPTG在16℃诱导24小时。

6. 一种重组载体，其特征在于，它为pET-GroES-RBS-ChSase ABC I或pET-GroES-T7-ChSase ABC I，其中，GroES基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述重组载体主要是由以下方法获得：分别克隆硫酸软骨素ABC酶蛋白基因和分子伴侣蛋白GroES基因，获得两个单独表达的蛋白基因；然后连接所述两个蛋白基因到同一个表达载体pET15b，使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白N端连接获得重组载体pET-GroES-RBS-ChSase ABC I，或者使后续得到的所述重组载体中的分子伴侣蛋白GroES和硫酸软骨素ABC酶蛋白具有单独的启动子获得重组载体pET-GroES-T7-ChSase ABCI；其中，所述分子伴侣蛋白GroES基因编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述硫酸软骨素ABC酶蛋白来源于普通变形杆菌。

7.一种转化体，其特征在于，它是将权利要求6所述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为E.coliBL21(DE3)或DH5α。