[发明专利]硫酸软骨素ABC酶蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种ChSaseABC酶蛋白的制备方法，该方法包括：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和分子伴侣蛋白GroES基因，然后连接上述两个蛋白基因到同一个表达载体，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的重组载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中进行表达，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的转化体；以及培养所述转化体，并进行物理破碎处理，制得所述硫酸软骨素ABC酶蛋白。本发明还提供一种ChSase ABC酶蛋白及其应用。上述ChSase ABC酶蛋白具有高酶活，能够用于生产低分子量硫酸软骨素，并且硫酸软骨素的生成条件不高、方法简便且容易控制。

技术领域

本发明涉及基因工程和发酵工程领域中一种硫酸软骨素ABC酶的制备方法及其应用。

背景技术

硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。

随着对ChSase的深入研究，发现硫酸软骨素ABC酶(简称为“ChSase ABC”)有着广泛的应用价值。科研人员利用ChSase ABC检测硫酸软骨素和生产低分子量硫酸软骨素。鲍伦军，杨建成等用ChSase ABC酶解-高效液相色谱的方法检测鱼翅中的透明质酸，采用ZORBAX糖分析柱，紫外检测波长为226 nm，检测到鱼翅中透明质酸的质量分数为0.86-1.96%（鲍伦军等. 鱼翅中硫酸软骨素的酶解-高效液相色谱法测定. 色谱，2002, 20(6): 557-559）。朱昱宁，敖雷等同样用酶解高效液相色谱的方法检测CS的含量，采用Ultimate XB-NH2柱，紫外检测波长为232 nm，流动相为醋酸钠缓冲液(pH5.6)-乙腈(950: 50)，流速为1.0 mL/min，此色谱条件可将CS A，B和C分开（朱昱宁等. 酶解高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量. 中国生化药物杂志，2012, 33(6): 827-829）。

ChSase ABC在临床应用方面也有很大的作用。例如，在缓解视网膜变性方面，可降解硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)，CSPGs是中枢神经系统(CNS)损伤后胶质瘢痕的重要组分，可抑制神经轴突再生；在提高后肢运动能力方面，ChSase ABC 可以修复脊柱损伤；近年来，Mark R Brown等经研究发现，突出椎间盘内的主要组分为蛋白聚糖，而用ChSase ABC 及ChSase AC则可特异性降解掉突出的椎管内的糖胺聚糖、降低椎管内压，同时对椎管外周组织无损害（Brown，M D．Method for treating intervertebral disc displacement withenzymes [P]: US, 4696816, 1987-09-29）。

另外，对低分子量硫酸软骨素的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。前两种方法需要较复杂的实验设备并且会污染环境，比较而言，酶解法需要的条件不高、方法简便且容易控制。酶解法的关键在于获得大量的硫酸软骨素裂解酶。分离纯化硫酸软骨素裂解酶的方法非常复杂，通常需要经过多步的色谱纯化，收率很低。异源重组表达ChSase ABC是常用来提高ChSase ABC产量的手段之一。然而对ChSase ABC的异源重组表达研究非常有限，现有技术中使用原核表达系统表达ChSase ABC酶蛋白后以活性蛋白状态存在的比例很低，变性蛋白需经过变性、复性过程，制备过程繁琐，成本较高。

发明内容

有鉴于此，为解决现有技术的不足，本发明采用分子伴侣协助硫酸软骨素ABC酶正确折叠的方法，获得了大量可溶性的ChSase ABC I蛋白，降低了包涵体的产量，大大减少了后续处理的复杂程序。

本发明的主要目的在于提供一种制备硫酸软骨素ABC酶蛋白的方法，其中，所述方法包括：

1）重组载体：分别克隆所述硫酸软骨素ABC酶基因和分子伴侣蛋白GroES基因，然后连接上述两个蛋白基因到同一个表达载体，获得含有所述硫酸软骨素ABC酶蛋白和分子伴侣蛋白GroES的重组载体；