[发明专利]检测O‑乙酰葡萄糖胺转移酶的纳米传感器及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于单个量子点检测O-乙酰葡萄糖胺转移酶的纳米传感器及其检测方法。

背景技术

蛋白糖基化是一种普遍存在的翻译后修饰，其中蛋白是由一个氧连接的N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)单体修饰在丝氨酸或苏氨酸残基，被称为氧连接型乙酰葡萄糖胺糖基化。O-GlcNAc在多种细胞过程中起着重要作用，包括信号传导，基因表达，蛋白质降解，新陈代谢，生物周期节律，和神经退行性疾病。人类氧连接乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)是一种细胞内源酶，催化从尿苷-乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的GlcNAc单体转移到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基形成的GlcNAc-β-丝氨酸/苏氨酸，而OGT活性的失调与多种疾病相关，如癌症，糖尿病，阿尔兹海默症。因此，OGT可能成为疾病治疗的潜在治疗靶标。

目前，检测OGT活性普遍通过监测放射性标记的糖基从糖供体(例如，UDP-[3H]-GlcNAc)转移到蛋白底物(例如，Nup62)来测量。但放射性标记的方法涉及昂贵的标记试剂和繁琐的分离程序。为了克服这些限制，多种非放射性方法已经被开发用于检测OGT，包括吸附酶联免疫测定(ELISA)，叠氮化-ELISA，镍-氨三乙酸板免疫测定法，抗蛋白酶裂解荧光共振能量转移(FRET)方法等。然而，这些方法因为需要转移溶液相酶反应产物到微孔板，特异性抗体(例如，特定的糖肽单克隆抗体，抗四甲基罗丹明抗体)，荧光UDP-GlcNAc的类似物的复杂化学合成，设计复杂的FRET染料对等，所以效率低、灵敏度相对较差。此外，OGT是对温度敏感的酶，并且在酶纯化过程中可能发生的酶活性的损失，因此定量检测实际样品中细胞内OGT活性是一个巨大的挑战。

因此，迫切需要开发一种不需要酶纯化过程的能够简单、快速的定量检测OGT活性和筛选OGT抑制剂的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于单个量子点检测O-乙酰葡萄糖胺转移酶的纳米传感器及其检测方法，本发明纳米传感器检测方法非常简单，不需要进行酶纯化，不需要放射性同位素标记的糖供体、特异性抗体和荧光UDP-GlcNAc类似物的合成，并且检测限可降低至3.47×10^-13摩尔每升，具有非常高的灵敏度。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明目的之一是：提供一种基于单个量子点检测O-乙酰葡萄糖胺转移酶的纳米传感器，其包括：花菁5/生物素修饰的肽链；非放射性尿苷-乙酰葡萄糖胺，蛋白酶K和被链霉亲和素包被的量子点。

本发明目的之二是：提供一种基于单个量子点检测O-乙酰葡萄糖胺转移酶的纳米传感器的检测方法，包括以下步骤：

S1.由糖供体尿苷-乙酰葡萄糖胺的糖基将花菁5/生物素修饰的肽糖基化；

S2.蛋白酶K区分糖基化和非糖基化肽；

S3.糖基化的肽通过链霉亲和素和生物素的相互作用自组装到量子点表面形成量子点-肽-花菁5的纳米结构和后续的荧光共振能量转移信号的测量。

本发明目的之三是：提供上述纳米传感器在酶动力学参数的测量、OGT抑制剂的筛选以及细胞OGT活性的定量检测方面的应用。

本发明纳米传感器以花菁5(Cy5)/生物素(biotin)修饰的肽链作为底物，此肽链具有能够被OGT糖基化的丝氨酸和与之相邻的蛋白酶识别的位点，用普通的非放射性UDP-GlcNAc的作为糖基供体。在OGT的存在下，它催化糖基化反应以产生糖基化的肽，肽链的糖基能够保护其不被蛋白酶裂解。再加入被链霉亲和素包被的量子点(QD)，该糖基化的Cy5/生物素修饰的肽通过生物素-链霉亲和素的相互作用可连接到QD表面，以形成QD-肽-Cy5的纳米结构，从而在QD和Cy5之间能够发生FRET。

与现有技术相比，本发明具有以下技术优点：

(1)本发明纳米传感器具有极高的灵敏度：本技术方案中利用OGT诱导的花菁5/生物素修饰的肽的糖基化和随后蛋白酶K裂解可以区分糖基化的肽和非糖基化的肽，并且本发明将多个的糖基化的底物肽组装到单一QD表面因而使得FRET效率高，此外，本发明使用单分子检测，其具有高信噪比的优点，因此，本发明纳米传感器具有极好的选择性以及非常高的灵敏度；

(2)本发明纳米传感器原理简单，成本低：整个过程不需要酶的纯化，也不许需要合成放射性标记的糖供体和特异性的抗体以及具有荧光基团的UDP-GlcNAc同源物；

(3)能够检测实际样品中细胞内的OGT活性。

附图说明

图1是本发明纳米传感器的机理图。