[发明专利]富集循环稀有细胞的试剂及方法

说明书

本发明涉及富集循环稀有细胞(CRC)的试剂及方法。本发明揭示了一种利用优选的CD标志物组合对血液中白细胞进行分离、从而富集CRC的方法，该方法为负向分选方法。本发明的方法可大幅度地提高细胞的识别准确度，实现高纯度CRC分选的突破，获得的样本更有利于直接应用于进行后续的基因组分析。同时，本发明还提供了应用于该方法的微流体检测装置。

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及富集循环稀有细胞的试剂、其用途，以及富集循环稀有细胞的方法。

背景技术

目前癌症个体化治疗方案的制定依赖于组织标本中肿瘤信息，但是在临床实践中组织标本难以获得，尤其在治疗过程中和癌症转移初期的组织标本。因此，寻找组织标本的替代者是目前癌症治疗监控与耐药机制研究最迫切的要求。

循环肿瘤细胞(CTC)是从原发肿瘤释放出来的细胞，其携带肿瘤特有的生物学信息。由于外周血检测的方便和及时性，CTC作为易获得的肿瘤信息载体可以提供动态监控肿瘤生物学特性变化的样本；科学研究也表明CTC是一个独立的肿瘤预后和预测因子，对患者CTC数量的动态监测可以及时了解患者疾病的进展状况以及干预治疗的效果。因此，研发并完善循环肿瘤细胞检测技术，使之可以更灵敏的检测多种类型的肿瘤和监控早中期患者的病情，能节约大量治疗成本，提高患者的生存质量，具有极大的社会意义。

循环肿瘤细胞被包含在循环稀有细胞(Circulating rare cells，CRC)中，CRC的检测与分离的技术本质就是如何对CRC从原始血样中加以辨认，然后将其从其他血细胞分离出来。当前CRC的分离技术主要分为两大类。

第一类方法是基于CTC的物理特征，如尺寸，变形率和电阻抗，对CRC和其他细胞进行区分和分离。然而，在细胞形态水平上，不同类型癌症的患者，同一种癌症的不同患者甚至同一患者血液中的CRC形态大小差异巨大。此外，虽然有一部分CRC尺寸明显大于白细胞，仍然有不少CRC的尺寸与形态与正常白细胞差别很小。因此，除了基于细胞尺寸的分离已经成功用于某些已知的大尺寸CRC，特别是CRC形成的细胞微栓，其余的分离技术尚未得到充分的病例验证。特别是其物理机理尚不清晰，尚未得到广泛验证与接受。

第二类方法基于CRC表面的蛋白标志物，采用磁珠或者某些微流体结构针对某些已知细胞标志物对CRC进行正向富集(如采用EpCAM)，或对白细胞进行负向去除(如采用CD45)。然而这两类CRC分离方法的缺点也非常明显。基于特定标志物的正向富集虽然容易获得较高的CRC纯度(1％)，但其提取率强烈依赖某些CRC特定标志物的表达水平，对不表达或低表达该蛋白的CRC无能为力。具有极强入侵能力的CRC均经历上皮细胞向间充质细胞的转化过程(EMT，epithelial mesenchymaltransition)。其现象是细胞上的表皮细胞特征(如EpCAM)消失，而间充质细胞标志蛋白获得表达。因此，基于EpCAM的CRC分离技术无法富集这一类极其重要的细胞。比如目前唯一商用的CellSearch系统仅能有效检测某几种癌症(如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌)的晚期癌症患者，而对一些发病率高和死亡率高的肿瘤(如肺癌，肝癌和胃癌)，该技术难以有效检出。此外，CellSearch对于癌症的早中期患者，检出率低于10％。另外，基于标志物的正向分离技术往往需要对细胞进行固定化、穿孔与细胞质角蛋白标记。经历这个过程后细胞已失去活性，无法用于很多后续分析譬如细胞培养和药物作用等。

与正向分离相比，负向分离技术采用白细胞特征标志物，力求最大程度地去除白细胞。整个过程不依赖肿瘤细胞标志物，可以最大限度地保留各种不同类型的CRC。然而目前的单一白细胞标志物均无法将白细胞全部标记和去除，因此尽管存留的CRC提取率很高，纯度却不太理想，通常在0.1％以下，无法对样品直接进行基因型分析。

因此，目前CRC的检测技术仍然存在着检测灵敏度低、适应肿瘤类型少、装置操作复杂和检测成本高昂的缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富集循环稀有细胞(Circulating rare cells，CRC)的试剂及方法。