[发明专利]一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法

权利要求书

1.一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤a、待测样品的处理：

将待测样品，依次经过缩分、粉碎、均质后，保存备用；

步骤b、皂化：

称取一定量的待测样品，先加入内标使用溶液，然后加入抗氧化剂后，再加入无醛乙醇和氢氧化钾溶液，在一定温度和磁力搅拌器的作用下进行回流皂化，皂化后立即冷却至室温，得到皂化液；

步骤c、提取：

将皂化液转移至分液漏斗中，加入萃取剂进行萃取，合并萃取后的萃取剂层溶液；

步骤d、洗涤：

用水洗涤萃取剂层溶液，直至将萃取剂层溶液洗至pH值为中性，去除下层水相，得到洗涤后的萃取剂层溶液；

步骤e、浓缩：

将洗涤后的萃取剂层溶液收集至蒸发装置，进行蒸发浓缩，待蒸发装置内溶液近干时，然后用正己烷定容得到待测浓缩液；

步骤f、净化：

f1)活化：将硅胶固相萃取柱用乙酸乙酯活化；

f2)平衡：用正己烷平衡硅胶固相萃取柱，使硅胶处于饱和状态；

f3)上样：准确量取步骤e制备的待测浓缩液，过柱；

f4)淋洗：用乙酸乙酯-正己烷溶液淋洗，分离掉杂质；

f5)洗脱：用乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱；

f6)氮吹定容：收集洗脱液，在一定温度下氮气吹干，然后加入甲醇，涡旋一定时间，再通过滤膜过滤后，得到待测溶液；

步骤g、高效液相色谱分析：

将得到的待测溶液注入高效液相色谱仪进行分析。

2.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤b中，所述内标使用溶液为维生素D2标准使用液，浓度为1μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤b中，氢氧化钾溶液的浓度为1g/ml，在70～90℃恒温、磁力搅拌器的作用下进行回流皂化50～60min。

4.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤b中，待测样品：抗氧化剂的质量比为(1.0～7.5):1.5；所述抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的混合物。

5.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：所述步骤c中，所述萃取剂是沸点为30～60℃的石油醚。

6.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤e中，所述蒸发装置为旋转蒸发瓶，在40℃水浴中减压蒸馏；或者蒸发装置为氮气浓缩管，采用气流浓缩。

7.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤f4中，淋洗用的乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯和正己烷的体积百分比为5:95。

8.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤f5中，洗脱用的乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯和正己烷的体积百分比为15:85。。

9.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤f6中，收集洗脱液，在40℃下氮气吹干，然后加入1ml甲醇，涡旋30s，再通过0.45μm有机系滤膜过滤后，得到待测溶液。

10.根据权利要求1所述的一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，其特征在于：步骤g中，高效液相色谱的条件如下：

色谱柱：C18柱，柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径5μm；

流动相：体积百分比为95～100％的甲醇水溶液；

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：264nm；

进样量：60～80μl。