[发明专利]一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及保健食品功效成分分析技术领域，具体涉及一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法。

背景技术

维生素D3为固醇类衍生物，又称胆钙化醇，主要来源于膳食摄入或紫外线照射下体内合成，能促进体内钙元素、磷元素的吸收，对儿童佝偻病及成人缺钙导致的疾病能够起到很好的预防作用。因此，维生素D3常被应用于补钙类的保健食品中。

随着保健食品的检测需求量与日俱增，目前对维生素D3的检测方法主要采用高效液相色谱法，其主要依据GB5009.82-2016第四法，采用正相-反相双系统检测即两台高效液相色谱仪，该检测方法的缺陷是：1)步骤繁琐且操作时间长，对操作人员的技术要求和实验室仪器条件要求非常高，操作人员在得到预处理样液后需要立刻进入正相系统分离且收集需要的保留时间段内的液体，并立刻予以氮吹，总处理时间过长则极易破坏维生素的含量；2)在收集维生素D3馏分时，操作者要先观察待测液中维生素D3在液相仪上的保留时间，再在管路的出口处收集其馏分，因而难以准确控制维生素D3在管路的流出时间，造成维生素D3的损失；3)这种方法对于实验室要求很高，需要两台高效液相色谱仪、正相色谱柱、仪器的使用成本(电)、仪器的日常维护，其费用成本非常高，不利于普及。

发明内容

针对现有技术存在上述技术问题，本发明的目的在于提供一种操作简单、准确控制、可操作性强且成本低的大豆蛋白粉维生素D3的测定方法。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

提供一种大豆蛋白粉维生素D3的测定方法，包括以下步骤：

步骤a、待测样品的处理：

将待测样品，依次经过缩分、粉碎、均质后，保存备用；

步骤b、皂化：

称取一定量的待测样品，先加入内标使用溶液，然后加入抗氧化剂后，再加入无醛乙醇和氢氧化钾溶液，在一定温度和磁力搅拌器的作用下进行回流皂化，皂化后立即冷却至室温，得到皂化液；

步骤c、提取：

将皂化液转移至分液漏斗中，加入萃取剂进行萃取，合并萃取后的萃取剂层溶液；

步骤d、洗涤：

用水洗涤萃取剂层溶液，直至将萃取剂层溶液洗至pH值为中性，去除下层水相，得到洗涤后的萃取剂层溶液；

步骤e、浓缩：

将洗涤后的萃取剂层溶液收集至蒸发装置，进行蒸发浓缩，待蒸发装置内溶液近干时，然后用正己烷定容得到待测浓缩液；

步骤f、净化：

f1)活化：将硅胶固相萃取柱用乙酸乙酯活化；

f2)平衡：用正己烷平衡硅胶固相萃取柱，使硅胶处于饱和状态；

f3)上样：准确量取步骤e制备的待测浓缩液，过柱；

f4)淋洗：用乙酸乙酯-正己烷溶液淋洗，分离掉杂质；

f5)洗脱：用乙酸乙酯-正己烷溶液洗脱；

f6)氮吹定容：收集洗脱液，在一定温度下氮气吹干，然后加入甲醇，涡旋一定时间，再通过滤膜过滤后，得到待测溶液；

步骤g、高效液相色谱分析：

将得到的待测溶液注入高效液相色谱仪进行分析。

其中，步骤b中，所述内标使用溶液为维生素D2标准使用液，浓度为1μg/ml。

其中，步骤b中，氢氧化钾溶液的浓度为1g/ml，在70～90℃恒温、磁力搅拌器的作用下进行回流皂化50～60min。

其中，步骤b中，待测样品：抗氧化剂的质量比为(1.0～7.5):1.5；所述抗氧化剂为抗坏血酸或抗坏血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的混合物。

其中，所述步骤c中，所述萃取剂是沸点为30～60℃的石油醚。

其中，步骤e中，所述蒸发装置为旋转蒸发瓶，在40℃水浴中减压蒸馏；或者蒸发装置为氮气浓缩管，采用气流浓缩。

其中，步骤f4中，淋洗用的乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯和正己烷的体积百分比为5:95。

其中，步骤f5中，洗脱用的乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯和正己烷的体积百分比为15:85。。

其中，步骤f6中，收集洗脱液，在40℃下氮气吹干，然后加入1ml甲醇，涡旋30s，再通过0.45μm有机系滤膜过滤后，得到待测溶液。

其中，步骤g中，高效液相色谱的条件如下：

色谱柱：C18柱，柱长250mm，柱内径4.6mm，粒径5μm；

流动相：体积百分比为100％的甲醇溶液；

流速：1ml/min；

柱温：35℃；

检测波长：264nm；