[发明专利]撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体K179M，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，是核酸序列为SEQ ID NO：1的7α‑羟基类固醇脱氢酶的第179位氨基酸由赖氨酸变为甲硫氨酸所得。该突变体对TCDCA的催化比活力是野生型的2.9倍。本发明的K179M突变体在生物转化TCDCA获得TUDCA的工业生产过程中具有巨大的应用潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不严格”的底物特异性。例如，早在二十世纪八十年代初科学家就已经开始尝试利用微生物产生的7α-、7β-HSDH联合差向异构转化鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA)合成熊去氧胆酸(Ursodesoxycholic acid，UDCA)，转化的过程如图1所示。而游离酶还可以催化结合态胆汁酸——牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)转化为牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholicacid，TUDCA)。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大应用潜力。然而，活性更高的HSDH改造体是其在生物转化领域进一步应用的基本保障。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，本领域现存的7α-HSDH共有5个，它们分别来自于Bacteroidesfragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum和Escherichiacoli。上述双酶偶联构建的生物转化体系不但克服了辅酶循环难题，还实现了氧化、还原“一锅式”进行特定化学区域的羟基差向异构。

酶的热稳定性较低是限制其工业应用的主要因素之一，因此，如何提高酶活及酶稳定性，并开发一种酶活和稳定性都很好的酶，是本领域目前急需解决的问题。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，本发明提供一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶(CA7α-HSDH)突变体，具有更高的催化效率，可用于多种底物的生物转化，在工业生产中有巨大的应用价值。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种提高野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的酶活及稳定性的方法，其特征在于，将所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶第179位的赖氨酸突变为甲硫氨酸。

所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；进行所述突变后得到的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶酶突变体的酶活及稳定性相较所述野生型撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶显著提高。

一种撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述的撒丁岛梭菌7α-羟基类固醇脱氢酶突变体K179M的基因。

所述基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

一种表达盒，其包含所述的基因。

一种载体，其包含所述的基因，和/或所述的表达盒。