[发明专利]一种沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用

说明书

本发明的目的是提供一种在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用。采用本发明的方法构建的慢病毒LV‑shWSB2具有使WSB2基因沉默效果，且能低表达WSB2蛋白，低表达WSB2蛋白能够抑制人黑色素瘤细胞A375的增殖。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的构建方法及其应用。

背景技术

黑色素瘤(melanoma)恶性程度高，对放化疗均不敏感。全球发病率及死亡率逐年上升，且呈年轻化趋势，提示其原因可能与某些内在致病基因相关并发挥重要作用。令人遗憾的是：黑色素瘤发病机理长期未获得突破性进展。因此，深入开展针对性的基因筛查研究有望为黑色素瘤防治提供新的干预策略。

最新研究表明，WSB2(WD repeat and SOCS box containing 2)蛋白分子量为45.3KDa，定位于细胞质及细胞核，是WD重复蛋白(wd-repeat protein)亚家族的成员。其蛋白结构中含5个WD重复序列和在C末端的SOCS框(Suppressor of cytokine signalingbox)。WD重复蛋白直接与泛素连接酶E3(E3Ubiquitin Ligases)结合，SOCS框与泛素化底物结合，充当E3酶与泛素化底物结合的桥梁。由于特殊蛋白结构，WSB2蛋白具有泛素连接酶的作用，可能与肿瘤发生密切相关。目前为止，尚无一种在黑色素瘤组织中特异性高表达的基因，因此探寻新的黑色素瘤组织相对特异高表达的基因，从分子、细胞、动物、临床组织四个方面阐明其在黑色素瘤的发生、发展变化中的复杂分子调控作用机理及其有关信号转导过程与机制，不仅有重要的分子/细胞生物学意义，而且对黑色素瘤的早期基因诊断及精准治疗，均具有重大临床应用价值和社会效应，有望取得新的突破。

因此，为诊断和治疗目的，研究和开发在黑色素瘤中高表达的基因和/或蛋白具有重大理论和现实意义。本领域迫切需要研究新的黑色素瘤组织高表达基因和/或蛋白，目前尚无WSB2在黑色素瘤中的研究报道。

发明内容

本发明涉及构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒，其特征在于：包含特异性靶向序列1“CTTCGAAGTTTCCTAACAA”、序列2“CGGCTTCTTACGATACCAA”、序列3“AGACACTATTACTGGCTTT”，可用于特异性沉默WSB2基因表达。

另外，本发明还涉及构建在人黑色素瘤细胞中沉默表达WSB2蛋白的慢病毒的方法，其包括如下步骤：

一、慢病毒LV-WSB2的构建。

1.利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)数据库，获得人WSB2基因的编码(CDS)区序列：