[发明专利]一种快速区分PCV2型和PCV3型的多重PCR检测引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及兽医生物技术领域的诊断技术，具体涉及一种快速区分PCV2型和PCV3型的多重PCR检测引物组及试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14－17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。PCV对外界理化因子的抵抗力相当强。即便在pH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。常见的PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。因此现有的PCV检测主要集中在PCV1和PCV2。近期，在我国八个省以及一个直辖市又检测到新的猪圆环病毒，其与传统的猪圆环病毒病所引起的临床症状一致，称为PCV3。都是目前，对PCV3的研究较少，且原有的对猪圆环病毒的检测分型方法已经难以满足实际需求。建立一种能够快速区分PCV2型和PCV3型的多重PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种快速区分PCV2型和PCV3型的多重PCR检测引物组及试剂盒，该试剂盒能够快速区分PCV2型和PCV3型，且灵敏度高、特异性强。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种快速区分PCV2型和PCV3型的多重PCR检测引物组，所述的引物组包括引物L1、L2、L3，其中：

L1：5’-TGTATCTCGCATGTGCAAGGGTACG-3’

L2：5’-TTCGAAGTTACTTAAGATGTAT-3’

L3：5’-ACCCACCCAATAAATACCCACACC-3’。

一种多重PCR检测引物组在制备猪圆环病毒分型检测试剂盒中的应用。

一种包含多重PCR检测引物组的猪圆环病毒分型检测试剂盒。

所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。

所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、L1引物、L2引物、L3引物、Taq DNA聚合酶和双蒸水。

所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5pmol/μL dNTP 4.0μL、25pmol/μL L1引物1.0μL、25pmol/μL L2引物1.0μL、25pmol/μL L3引物1.0μL、5U/μL Taq DNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。

一种试剂盒的使用方法，包括核酸提取、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。

试剂盒的使用方法，还包括对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析：当扩增片段为1326bp，则样本中的圆环病毒为PCV2型；当扩增片段大小为758bp，则样本中的圆环病毒为PCV3型。

所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果：

本发明根据GenBank中收录的PCV2型和PCV3型序列，通过比对PCV2型和PCV3型之间的差异，自行设计特异性引物L1、L2和L3，该引物组能够对PCV2型和PCV3型进行特异性扩增，其中，使用L1和L2引物可以扩增PCV2型，使用L1和L3引物可扩增PCV3型。发明人在此基础上成功研制了专用试剂盒，先提取病毒DNA，在此基础上利用PCR方法鉴别检测猪圆环病毒不同血清型，并且在聚合酶链式反应(PCR)过程中，不断优化PCR反应体系和反应程序，包括退火温度的设定、引物的浓度循环数，最终确定了最佳的反应体系和PCR反应程序。采用PCR方法鉴别检测PCV2型和PCV3型，PCV2型预期扩增片段大小为1326bp，PCV3型预期扩增片段大小为758bp。与现有技术相比，本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，对PCV2型和PCV3型的最低模板检测浓度分别为1×10^-7ng/mL和2×10^-7ng/mL；特异性强，对猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒的扩增结果均为阴性；重复性好，对同一样品进行3次检测，每次间隔一个月，都能获得同样的结果；且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达95％以上，能够广泛用于临床PCV2型和PCV3型的分型检测。