[发明专利]一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法

权利要求书

1.一种富含绿原酸类物质金银花细胞的生产方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、预处理

金银花嫩芽先用清水冲洗，再放到洗衣粉溶液中浸泡，接着用清水冲洗干净，晾干；

B、消毒

步骤A得到的晾干金银花嫩芽在酒精溶液中进行消毒处理，接着在次氯酸钠水溶液中进行消毒处理；

消毒处理的金银花嫩芽用无菌水冲洗3～5次，接着置于无菌滤纸上吸干水分，再在无菌条件下将金银花嫩芽切成尺寸为0.4～0.6cm的切伤金银花嫩芽段；

C、配制培养基

(i)愈伤组织诱导培养基

称取4.74gMS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解胀，在微波功率800W下加热6min使其溶解，制成1LMS固体培养基，再加入NAA、KT、2,4-D与6-BA植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/LNAA、0.75mg/LKT、1.0mg/L2,4-D与0.15mg/L6-BA，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的愈伤组织诱导培养基。

(ii)继代培养基

称取4.74g MS培养基粉、7g琼脂与30g蔗糖，加水溶解制成1L MS固体培养基，再加入6-BA、NAA与2,4-D植物激素，使它们的浓度分别达到1.5mg/L 6-BA、0.2mg/LNAA与0.1mg/L 2,4-D，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后按照50mL/瓶分装于培养瓶中，置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的继代培养基。

(iii)细胞悬浮培养基

往4.74g/L液体MS培养基中加入6-BA、NAA、2,4-D植物激素与蔗糖，使它们的浓度分别达到1.4mg/L 6-BA、0.5mg/LNAA、0.7mg/L 2,4-D以及30g/L蔗糖，混合均匀，得到的溶液再使用无机酸或无机碱水溶液将其pH值调节至5.8，然后置于灭菌锅中灭菌，接着冷却至室温，得到所述的细胞悬浮培养基。

D、愈伤组织

在无菌的条件下，把步骤B的切伤金银花嫩芽段接种到步骤C(i)制备的愈伤组织诱导培养基上，在人工智能气候箱中暗培养9天，接着在有光与黑暗的条件下交替培养，其中每天在光照2000lux下培养14h，在培养6～8天后，金银花嫩芽在伤口处长出愈伤组织，20～24天愈伤组织生长量达到高峰，此时在无菌条件下取出愈伤组织；

E、继代培养

在无菌的条件下，把步骤D取出的愈伤组织接种到步骤C(ii)制备的继代培养基中，放置于人工气候箱中进行光、暗交替培养，光照强度为2000lx，光照时间为14h·d^-1，培养20～24天，得到生长良好的愈伤组织；

F、金银花细胞悬浮培养体系建立

在无菌的条件下，用镊子将步骤E生长良好的愈伤组织夹碎；按照接种量0.2g/mL，把夹碎的愈伤组织接种到步骤C(iii)制备的细胞悬浮培养基中振荡培养6～8天，得到主要以2～10个细胞团形式与少数为单细胞存在的金银花细胞悬浮培养体系

G、后处理

让细胞悬浮培养体系进行振荡培养，从第5天细胞数量急剧增加时加入茉莉酸甲酯与水杨酸，使该体系的茉莉酸甲酯浓度达到200μmol/L、水杨酸浓度达到50μmol/L，同时使用紫外灯在紫外强度133lx下照射2h·d^-1，接着再在同样条件下培养6～8天，得到252～261g/L金银花细胞的培养液，过滤，用蒸馏水洗净，沥尽水分，将富含绿原酸类物质的金银花细胞烘干，得到质量浓度为20.1～20.8g/L的富含绿原酸类物质的金银花细胞。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤A中，金银花嫩芽用清水冲洗4～6次，然后在浓度为以重量计1.5～2.5％的洗衣粉溶液中浸泡15～20min。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤A中，晾干金银花嫩芽在浓度为以体积计65～75％酒精溶液中消毒处理25～30s，再在浓度为以重量计4～6％的次氯酸钠水溶液中消毒处理8～12min。