[发明专利]从宿主细胞提取和纯化腺相关病毒和腺病毒的方法及其组分和试剂盒

说明书

本发明提供了从含有包装病毒颗粒的宿主细胞的样品中提取和纯化病毒颗粒的三级纯化的方法。三级纯化的方法包括：利用第一次分级分离溶液沉淀并去除大多数的杂质蛋白质；用第二次分级分离溶液沉淀并收集病毒颗粒，去除部分剩余杂质；收集到的病毒颗粒进一步用柱层析去除剩余杂质，得到超纯的病毒溶液。该方法还包括病毒宿主细胞的收集、细胞悬浮和细胞裂解等步骤。这种纯化方法操作简便、方便得到很高回收率的超纯度的病毒溶液、适宜于大量和小量制备，而且所用溶液和操作步骤都不含有对细胞的有毒物质。因此，这一方法展示了一种非常理想的包括腺相关病毒和腺病毒在内的载体病毒的纯化技术。本发明还包括根据上述技术设计出的试剂盒或包装。

技术领域

本发明属于生物技术和医药学研究领域，大体涉及病毒颗粒的纯化，更具体是，涉及从宿主细胞中提取、纯化在宿主细胞中完成包装的腺相关病毒和腺病毒等载体病毒颗粒的方法及其组分和试剂盒。

背景技术

以病毒载体为介导的外源基因和小分子非编码RNA（例如siRNA 和miRNA）转入(delivery)是一种非常有效的工具，在基础研究和医疗研发中应用广泛。当前应用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒（AAV）和单纯疱疹病毒（HSV），在最近研究文献的应用中，逆转录病毒和慢病毒的应用最多。逆转录病毒和慢病毒属于逆转录病毒类，这类病毒在宿主细胞中完成包装后即分泌在细胞的培养基中。这种特征使得这些病毒能够通过超速离心从介质直接收集，因此，便捷的纯化是逆转录病毒和慢病毒应用广泛的原因。相比之下，腺病毒和腺相关病毒是所谓的“裸露病毒”，这类病毒在其宿主细胞中完成包装之后大多停留在宿主细胞之内，因而纯化困难。在过去数十年中研究者付出了许多努力，研发出多种纯化AAV 和腺病毒的方法，包括基于氯化铯（CsCl）和碘克沙醇的密度梯度超速离心、亲和层析法和离子交换层析法。遗憾的是这些方法要么操作费力和费时，要么所得病毒纯度和回收率低下。因为梯度超速离心可以制备较高纯度的病毒，它仍然是AAV 纯化的常用技术。但是，这种技术在应用中存在一些严重限制：（1）显著降低感染活性、（2）存在梯度介质相关的健康风险、（3）梯度介质可能的毒性、（4）生产规模的局限性和（5）操作程序繁琐。

AAV 和腺病毒是天然存在的病毒。AAV 是唯一的已经被广泛地证实不会引起细胞毒性和免疫反应的病毒载体，但腺病毒不同，已经被发现会引起免疫反应。除此之外，AAV表现出在分裂细胞和非分裂细胞（例如神经元细胞）中都能有效的转导和稳定的表达，因此，在基因疗法的基础研究和产业研发中被视为最为有效的病毒载体。一个例子是Glybera，它是在2012 年被欧盟批准的首个基因疗法药物，用AAV 作为载体成功地转导脂蛋白脂肪酶基因，以治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症。当前在美国和全世界范围内，许多医药公司都在用 AAV作载体研发基因疗法药物。基于这样的应用进展，开发一种方便、高效的纯化AAV 病毒的新技术显得尤为迫切。

发明内容

本发明在一些实施方式中展示出一些方法，用于宿主细胞的裂解及从宿主细胞中提取和纯化腺相关病毒（AAV）或腺病毒（AdV）。这些方法包括用一种碱性裂解溶液裂解细胞，这种碱性裂解溶液包含一种或多种有pH 缓冲能力的化合物或试剂 和适中的洗涤剂（detergent）；细胞裂解后用一种盐析溶液沉淀并去除大多数的宿主细胞的蛋白质，这种盐析溶液包含一种盐，且偏酸性。由此提取的病毒溶液可以用聚乙二醇 (PEG) 脱盐并富集、然后用层析法进一步纯化。

在本发明的一个实施方式中，提供了一种从包装有重组AAV 或腺病毒病毒颗粒的宿主细胞样品中提取这些病毒颗粒的方法。在另一些实施方式中，这一方法包括用一种碱性裂解溶液裂解细胞，具体是在细胞样品中加入碱性裂解溶液，使样品中含有约0.1%至约1%的洗涤剂并保持pH 值约9.0 至约11.5。在一个实施方式中，这一方法进一步包含用一种盐析溶液沉淀并去除大多数的宿主细胞的蛋白质，这种盐析溶液的盐浓度为约0.5 M至约2.0 M，其pH 值为约4.0 至约7.0。