[发明专利]一种高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高产纳豆激酶的枯草芽抱杆菌及其应用。

背景技术

截止到2016年，我国60岁以上老年人口为2.2亿人，占总人口的16.1％，中国已进入老龄化社会。血栓性疾病是中老年人群的高发病，是现今仅次于癌症的第二大病症，具有很高的死亡威胁。据世界卫生组织统计，目前全球每年有约1700万人死于心脏病和其他心脑血管疾病，占全球死亡人数的三分之一。目前，溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段，当今用于临床治疗的药物包括链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿激酶型血纤溶酶原活剂、化学修饰的血纤溶酶一链激酶激活剂复合物等，但是这些药物都存在明显不足：全身性出血副作用、药物半衰期短、价格昂贵等，因此，开发新型溶血栓药物已成为当前重要研究课题之一。

纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓、降低血粘度，改善血液循环，软化和增加血管弹性等作用。纳豆激酶对纤溶蛋白原不敏感，但可直接水解交联纤维蛋白，将其转变为可溶性物质，达到溶栓目的。此外纳豆激酶可以间接促进组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的生成，并可以激活体内的纤溶酶原转变成纤溶酶而作用于纤维蛋白，所以纳豆激酶具有直接溶解纤维蛋白及通过调节和尿激酶间接溶解纤维的功能。

纳豆激酶作为新一代溶栓药物具有药理作用直接且多元化、体内半衰期长、分子量相对较小可直接通过胃肠系统被人体吸收、价格便宜等优点。并且纳豆激酶只溶解血栓的主体物质纤维蛋白，不水解血浆纤维蛋白原，所以不会引发出血的危险，同时，还能激活增强人体自身的溶栓能力，从而起到持久平稳的溶栓作用。然而目前国内的纳豆激酶产品活性普遍比较低，筛选具有高活力纳豆激酶生产能力的菌株，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.UJS-11，该菌株具备高产纳豆激酶的特征，将该菌株应用于纳豆激酶的液态发酵，提高了发酵液中纳豆激酶含量，以解决纳豆激酶大规模工业液态发酵缺乏优良菌种，纳豆激酶生产成本高的实际问题。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏编号：CGMCC No.14435，保藏时间：2017年07月17日。建议的分类命名：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.

本发明还有一个目的在于提供一种枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.UJS-11在制备纳豆激酶预防心脑血栓疾病保健品与食品中的应用。

一种利用枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.UJS-11制备纳豆激酶发酵液与提纯品中的方法，按照下述步骤进行：

1)含有纳豆激酶发酵液的制备：

将枯草芽孢杆菌亚种Bacillus subtilis subsp.UJS-11菌株接种到LB平板培养基上37℃活化24小时，接种到种子液二次活化后按5％的接种量接种到液体发酵培养基中，37℃，200rpm条件下发酵48h，取发酵液离心，利用琼脂糖——纤维蛋白平板法测得发酵上清液酶活为35850u/ml。

2)纳豆激酶的提纯：

将发酵液在4℃，10000rpm，20min条件下离心，收集发酵上清。向上清液中分多次加入硫酸铵粉末，达到30％饱和度。4℃低速颠倒混合盐析6小时，4℃，10000rpm，20min条件下离心，收集上清液。向上清液中分多次加入硫酸铵粉末，达到75％饱和度。4℃低速颠倒混合盐析6小时，4℃，10000rpm，20min条件下离心，收集沉淀。用适量PH7.2的PBS缓冲液溶解沉淀，-80℃冷冻，送冻干机冻干，收集冻干粉即为高纯度的纳豆激酶粉，利用琼脂糖——纤维蛋白平板法测得高纯纳豆激酶粉酶活为594730u/g。

一种可预防心脑血栓疾病的纳豆激酶保健品的的制备方法，按照下述步骤进行：

1)按质量百分比，将干燥后含水量在4-6％的上述过程制备的高纯纳豆激酶粉5％，纳豆冻干粉35％，维生素C 10％，乳酸钙10％，枸杞提取物5％，百合提取物5％，麦芽糊精26％在混料机混合均匀。

2)经过公知方法的造粒，干燥后加入4％的硬脂酸镁，混合均匀后，送入压片机压片，每片500mg。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：